細(xì)胞凋亡檢測(cè).ppt

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1、三、細(xì)胞生長狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞生長曲線細(xì)胞分裂指數(shù)克隆形成率1、細(xì)胞計(jì)數(shù)法細(xì)胞計(jì)數(shù)法是用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，以測(cè)定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度。臺(tái)盼藍(lán)染色法用于檢測(cè)存活細(xì)胞數(shù)。注：臺(tái)盼藍(lán)染色——排除檢測(cè)法，由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，染料可大量進(jìn)入?yún)s不能被排出，因而細(xì)胞被染色；而活細(xì)胞能拒染，因而不易著色。Trypanbluestainingofadultratcardiacmyocytesinprimaryculture.Livecellsexcludethebluedye,andsoappearclear.Deadcellstak

2、eupthedyeandappearblue.結(jié)果分析細(xì)胞密度細(xì)胞數(shù)/ml＝（4大格細(xì)胞數(shù)之和/4）×104×稀釋倍數(shù)細(xì)胞存活百分率細(xì)胞活力（％）＝未著色細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100％2、細(xì)胞生長曲線細(xì)胞生長曲線是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中最基本的指標(biāo)，是觀察同一代細(xì)胞的增殖過程。根據(jù)細(xì)胞生長曲線分析細(xì)胞增殖方法一：在同一規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，接種同等量的同一代細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后每隔24h取出幾瓶細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，不同時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，即為該細(xì)胞的生長曲線。方法二：四氮唑鹽（MTT）比色法3、細(xì)胞分裂指數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)是表示細(xì)胞增殖旺盛程度的指標(biāo)；以被測(cè)1000個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì)

3、胞數(shù)來計(jì)算。方法：染色后血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞分裂指數(shù)＝細(xì)胞分裂相數(shù)/細(xì)胞總數(shù)（1000）×100％4、克隆形成率克隆形成率所計(jì)數(shù)的細(xì)胞必為貼壁和有增殖能力的細(xì)胞，反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力。各種細(xì)胞克隆形成率差別很大，一般初代細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。方法克隆形成率＝克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％注意：細(xì)胞要分散好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不要過大。四、細(xì)胞生物活性的化學(xué)檢測(cè)法四氮唑鹽（MTT）比色法細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定法細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的3H-亮氨酸摻入試驗(yàn)細(xì)胞DNA合成的3H-TdR摻入試驗(yàn)1、

4、四氮唑鹽（MTT）比色法原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將MTT黃色溶液還原成不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，并沉積于細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）和酸化的異丙醇或酸化的SDS等均能溶解細(xì)胞中的紫藍(lán)色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，在490，570nm波長處測(cè)定其光吸收值（OD），可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)值范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。此法已廣泛用于生物活性因子的活性檢測(cè)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、抗腫瘤藥物篩選和腫瘤放射敏感性測(cè)定等。操作步驟（1）單細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板；103-104細(xì)胞/孔，每孔培養(yǎng)基總量200μl,37℃、5％CO2培養(yǎng)箱

5、中培養(yǎng)一段時(shí)間（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定培養(yǎng)時(shí)間）（2）加入2mg／ml的MTT液（50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。（3）吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO液（150μl／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結(jié)晶物溶解。（4）酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值（檢測(cè)波長為490或570nm）。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞生長曲線2、細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定法（考馬斯亮藍(lán)測(cè)定法）原理：考馬斯亮藍(lán)在酸性溶液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，在595nm波長處呈現(xiàn)最大吸收量，其吸光值與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。此法主要用于測(cè)定酶、受體及細(xì)胞外代謝產(chǎn)物特異性活性的度量單位。3、細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的3H-亮氨酸摻入實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞在合

6、成蛋白質(zhì)時(shí)需攝取外源性氨基酸，用核素標(biāo)記氨基酸，如3H-亮氨酸，可以摻入細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝中，通過測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可了解細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝狀況。4、細(xì)胞DNA合成的3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)原理：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì)。用核苷3H標(biāo)記TdR即3H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DNA合成代謝過程，通過測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DNA的代謝及細(xì)胞增殖情況。五、細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法（一）、凋亡概念：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞循自身程序結(jié)束其生命的主動(dòng)死亡的過程，具有特征的形態(tài)和生化改變，是由基因控制的個(gè)別細(xì)胞發(fā)生的自主有序的死亡。即是

7、由基因控制細(xì)胞有目的，有選擇性的自我消亡過程，這種淘汰機(jī)制是保證生命進(jìn)化的基礎(chǔ)。a、凋亡概念的形成和形態(tài)學(xué)的研究(1972）1965年發(fā)育生物學(xué)家Lockshin在研究硪發(fā)育過程中首次提出程序化死亡（programmedcelldeath）概念。1971年澳大利亞生物學(xué)家Kerr用皺縮死亡來區(qū)別經(jīng)典的細(xì)胞壞死。1972年Kerr等在英國癌癥雜志發(fā)表論文，首次提出細(xì)胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開始。b、DNA的降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的參與。(1987）c、蛋白質(zhì)水解酶活化的研究(1995)d、細(xì)胞膜的變化(