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《分子克隆方法之同源克隆方法(20160115).ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在PPT專區(qū)-天天文庫。
1、第一部分---從頭合成質(zhì)粒單片段克隆多片段克隆第二部分---已有質(zhì)粒改造突變?nèi)笔Р迦敕肿涌寺≈纯寺》椒◤念^合成質(zhì)粒之單片段克隆用含有質(zhì)粒同源序列的引物做PCR擴增出含質(zhì)粒同源序列的目的基因片段從cDNA做PCR獲取包含目的基因CDS序列的片段含目的基因片段的質(zhì)粒單片段克隆流程圖目的質(zhì)粒同源反應PCR產(chǎn)物純化目的載體線性化（PCR或酶切）及純化+轉(zhuǎn)化AAA…5’3’5’3’3’5’cDNA質(zhì)粒5’3’3’5’正向引物(實線)反向引物(實線)目的基因片段PCR擴增出含質(zhì)粒同源序列的目的基因片段PCR獲取包含目的基因CDS
2、序列的片段目的基因片段質(zhì)粒同源序列（15-20bp）質(zhì)粒同源序列CDS區(qū)域單片段克隆原理圖一與基因互補序列（18-27bp）5’3’3’5’3’5’5’3’線性化載體目的質(zhì)粒同源反應示意圖3’--->5’外切酶活性PCR產(chǎn)物純化目的載體線性化（PCR或酶切）及純化+單片段克隆原理圖二PCR反應體系(TakaraPrimeSTAR)PCR儀設(shè)置*建議模版量小于10ng (尤其是模板為含目的基因片段的質(zhì)粒)*擴增條帶特異時無需切膠回收，可直接用DNA純化試劑盒純化PCR反應體系(以TakaraPrimeSTAR為例)同源反應
3、體系(標準版)同源反應體系(簡便版)同源反應體系（Vazyme產(chǎn)品）*同源反應37℃30min，后置于冰上5min*同源反應產(chǎn)物全部用于轉(zhuǎn)化100μL感受態(tài)細菌(慢病毒載體需要用Stbl3感受態(tài))*同源反應產(chǎn)物可保存于-20℃*已線性化質(zhì)粒：pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neoPCDNA3.1+pcDNA6myc-His_ApDsRed-Monomer-C1pEGFP-N1pGEX-6P-1…從頭合成質(zhì)粒之多片段克隆用包含同源序列的引物做PCR擴增出含同源序列的片段1從cDNAPCR獲取包含目的片段1含目的片段1的
4、質(zhì)粒目的質(zhì)粒同源反應片段1PCR產(chǎn)物純化目的載體線性化（PCR或酶切）及純化片段2PCR產(chǎn)物純化片段3PCR產(chǎn)物純化+++…+轉(zhuǎn)化多片段克隆流程圖3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’線性化載體目的質(zhì)粒多個片段PCR及其產(chǎn)物純化目的載體線性化（PCR或酶切）及純化+引物設(shè)計同源反應多片段克隆原理圖（方法一）---更適用于單個位置突變數(shù)較多突變位點設(shè)計在同源序列內(nèi)5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’線性化載體目的質(zhì)粒多個片段PCR及其產(chǎn)物純化目的載體線性化（PCR或酶切
5、）及純化引物設(shè)計同源反應+多片段克隆原理圖（方法二）---適用于僅多片段融合或單個位置僅一個點突變突變位點設(shè)計在同源序列內(nèi)PCR反應體系(TakaraPrimeSTAR)PCR儀設(shè)置*建議模版量小于10ng (尤其是模板為含目的基因片段的質(zhì)粒)*擴增條帶特異時無需切膠回收，可直接用DNA純化試劑盒純化PCR反應體系(以TakaraPrimeSTAR為例)同源反應體系(標準版)同源反應體系（Vazyme產(chǎn)品）*同源反應37℃30min，后置于冰上5min*同源反應產(chǎn)物全部用于轉(zhuǎn)化100μL感受態(tài)細菌(慢病毒載體需要用Stb
6、l3感受態(tài))*同源反應產(chǎn)物可保存于-20℃*已線性化質(zhì)粒：pCDH‐EF1‐MCS‐IRES‐neoPCDNA3.1+pcDNA6myc-His_ApDsRed-Monomer-C1pEGFP-N1pGEX-6P-1…已有質(zhì)粒改造之突變以質(zhì)粒為模版用包含同源序列的引物做PCR，擴增得到線性質(zhì)粒目的質(zhì)粒同源反應PCR產(chǎn)物純化轉(zhuǎn)化質(zhì)粒突變流程圖質(zhì)粒突變原理圖一第一輪PCR示意圖第二輪PCR示意圖第二輪PCR線性化示意圖引物（實線）需突變區(qū)域（漸變色）質(zhì)粒突變原理圖二第三輪及之后PCR示意圖同源反應示意圖目的質(zhì)粒第三輪及之后P
7、CR線性化示意圖PCR反應體系(TakaraPrimeSTAR)PCR儀設(shè)置*建議模版量小于10ng*擴增條帶特異時無需切膠回收，可直接用DNA純化試劑盒純化*擴增效率不佳時，可延長至≤35CyclesPCR反應體系(以TakaraPrimeSTAR為例)同源反應體系(標準版)同源反應體系(簡便版)同源反應體系（Vazyme產(chǎn)品）*同源反應37℃30min，后置于冰上5min*同源反應產(chǎn)物全部用于轉(zhuǎn)化100μL感受態(tài)細菌(慢病毒載體需要用Stbl3感受態(tài))*同源反應產(chǎn)物可保存于-20℃已有質(zhì)粒改造之缺失片段以質(zhì)粒為模版用
8、包含同源序列的引物做PCR，擴增得到線性質(zhì)粒目的質(zhì)粒同源反應PCR產(chǎn)物純化轉(zhuǎn)化質(zhì)粒片段缺失流程圖質(zhì)粒片段缺失原理圖一第一輪PCR示意圖第二輪PCR示意圖第二輪PCR線性化示意圖引物（實線）需缺失區(qū)域（紫色）質(zhì)粒片段缺失原理圖二第三輪及之后PCR示意圖同源反應示意圖目的質(zhì)粒第三輪及之后PCR線性化示意圖PCR反應體系(
