怎樣選擇色譜柱,液相色譜柱的種類與方法開發(fā)

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1、液相色譜柱的選擇和方法開發(fā)奧秘科技/AUMITechnologies（US）內(nèi)容概要色譜基本概念回顧色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)色譜基本概念回顧色譜（chromatography）色譜原理色譜分類：氣相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/離子交換/HILIC/混合固定相色譜功能：分析（種類/定量），純化液相色譜儀器結(jié)構(gòu)及功能：泵，脫氣機，混合器，進樣器（閥），色譜柱，柱溫箱，檢測器（流通池）分離度Rs-ResolutionN–TheoreticalPlateNumberα–Selectivit

2、yk–RetentionFactor拖尾1.SeparationofCompoundsAandB靈敏度ＬＯＤ：LimitofDetectionＬＯＱ：LimitofQuantification－柱效－峰形（拖尾因子）重現(xiàn)性分離度（Ｒ）－保留時間（Ｖ，Ｔ，Ｋ）－選擇性（α）－柱效?。ǎ危╈`敏度色譜柱類型、選擇和方法開發(fā)色譜柱與色譜條件對色譜性能的影響分離度《-選擇性〈鍵合類型，基質(zhì)表面特性；流動相、溫度-柱效〈保留體積，粒徑，柱長，基質(zhì)表面特性；流動相，溫度，上樣量，流速峰對稱性《基質(zhì)表面特性，鍵合

3、類型，流動相，溫度保留體積《柱長，孔隙率，比表面積，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動相，溫度靈敏度《粒徑，基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動相，溫度穩(wěn)定性和重現(xiàn)性《基質(zhì)表面特性，鍵合類型；流動相，溫度流動相《pH，緩沖鹽種類，溶劑；影響色譜柱性能的主要因素1、色譜柱的構(gòu)型色譜柱內(nèi)徑色譜柱長度2、固定相柱填料粒徑比表面積孔徑孔隙率基質(zhì)表面特性：-表面活性：硅膠純度、硅羥基的酸性、均勻性和數(shù)量-耐堿性鍵合類型-官能團、是否封尾-鍵合相的保留行為、耐酸性色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響色譜柱的構(gòu)型對色譜柱性能的影響

4、：長度和直徑色譜柱尺寸對色譜分離的影響：?短柱(15-100mm)-運行時間短,柱壓低?長柱(150-250mm)-分辨率高,運行時間長?窄徑柱(?2.1mm)–滿足檢測器和樣品量限制?寬徑柱(3-7.8mm)-載樣量高，抗污染，壽命制備柱(內(nèi)徑>10mm)–用于純化制備柱填料對色譜柱性能的影響柱填料對C18色譜柱性能的影響：粒徑硅膠粒徑和類型對柱效的影響d硅膠粒徑和類型對壓力的影響柱填料對C18色譜柱性能的影響：粒徑II目前市場主要可供選擇的填料粒徑1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色

5、譜柱：匹配快速色譜儀2.7μm－多孔殼層：在常規(guī)液相色譜儀上實現(xiàn)快速分離(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常規(guī)分析顆粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱壓升高.柱填料對C18色譜柱性能的影響：比表面積每克填料的表面積，與粒度，孔徑有關(guān)比表面積大，保留增加，載樣量增加，平衡時間增加(梯度洗脫尤為注意)根據(jù)需要選擇合適的比表面積柱填料對C18色譜柱性能的影響：孔徑I多孔材料的95%以上表面在孔內(nèi)部樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進入微粒內(nèi)部孔徑至少是樣品流體學(xué)直徑的4倍30

6、0?孔徑用于：超過50個氨基酸的肽或25個殘基的低聚寡核苷酸樣品分子直徑小于平均孔徑，才能進入微粒內(nèi)部柱填料對C18色譜柱性能的影響：孔徑II由于小孔徑填料比表面積大，小分子的保留值在小孔徑填料通常更大條件：C8色譜柱，4.6×150mm，3.5um，A溶劑，0.1%TFA水溶液；B溶劑，0.1%TFA于80%乙腈－水中；20min梯度，1030%B；60°C，1.5ml/min柱填料對C18色譜柱性能的影響：硅膠純度I2.3-二羥基萘2.7-二羥基萘TF=1.31BrandW,AQColumn5

7、μm,4.6mm×150mmBrandZ,C18Column5μm,4.6mm×150mmVenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmBrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流動相：甲醇：水=65：35流速：1mL/min溫度：35℃檢測波長：230nm進樣量：20μL硅膠純度－金屬含量硅膠基質(zhì)類型及發(fā)展史TypeA：原料來源：水玻璃；高金屬含量，高活性

8、，極性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB：原料來源：有機硅烷（四乙氧基硅烷）水解/燒結(jié)/酸洗雜化及表面雜化整體柱殼層柱柱填料對C18色譜柱性能的影響：硅膠純度II硅膠純度－金屬含量d固定相對色譜柱性能的影響：硅羥基的影響殘余硅羥基的影響普通硅膠當(dāng)流動相的pH值大于4.5-5.0時，表面的硅羥基會帶負電荷，堿性化合物拖尾。解決方法封尾雙層表面修飾表面雜化固定相對色譜柱性能的影響：殘余硅羥基的影響封尾鍵合填料與小硅烷進行后續(xù)反應(yīng)，如三甲基氯硅烷，反應(yīng)掉部分殘余硅羥基，以增加表面覆蓋率