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1、第4O卷分析化學(FENXIHUAXUE)研究報告第11期2012年11月ChineseJournalofAnalyticalChemistryl73O～1734直接競爭酶聯(lián)免疫吸附一高效液相色譜法測定烯效唑張良王泉振王寧劉曙照(揚州大學園藝與植物保護學院，環(huán)境科學與工程學院，揚州225009)摘要應用本實驗室制備的對烯效唑具特異性親和力的多克隆抗體，采用包被抗體直接競爭模式建立烯效唑的酶聯(lián)免疫吸附分析法。在優(yōu)化條件下，對烯效唑標樣檢測的線性范圍為1～10mg／L，線性中濃度為1．3lL，5次重復測定的相對標準偏差(RSD)為8．4％；檢出限為0．022g／L。在蘋果中分別
2、添加烯效唑標樣1．0，0．1和0．01mg／kg；直接競爭ELISA法測定的回收率分別為84．6％～101．0％，99．6％～117．0％和80．8％～92．8％；RSD(，z一5)分別為8．6％，6．9％和6．7％。ELISA法對蘋果中烯效唑的檢出限為0．024p,g／kg。在同樣前處理條件下，高效液相色譜一紫外檢測(HPLC-UVD)法對蘋果中烯效唑的檢出限為0．25mg／kg，蘋果中添加1．O0mg／kg烯效唑，HPLC-UVD法測定的回收率為92．6％。關鍵詞烯效唑；蘋果；直接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析；高效液相色譜1引言烯效唑(Uniconazole，結構式見圖1)是一
3、種廣譜、高效植物生長調節(jié)劑，高濃度時兼有殺菌和除草作用。烯效唑通過抑制赤霉素合成，控制植物的營養(yǎng)生長，縮短節(jié)間長度、矮化植株，具有增進植物抗逆性、提高產(chǎn)量的作用】，在農作物、果樹、蔬菜、煙草、花卉等作物上應用廣泛口】。OH烯效唑在作物體內較為穩(wěn)定，殘效期長，殘留于作物體內可能對人體健康產(chǎn)生不利影響。另外，殘留于土壤中的烯效唑對土壤中微生物的活性也會造成顯著影響]。日本規(guī)定，糧果中烯效唑的最大殘留限量N—N(MRL)為0．01mg／kg。因此，建立高效快速、高靈敏度的烯效唑殘留監(jiān)測方圖1烯效唑結構式法，對保障人體健康和農產(chǎn)品國際貿易的順利進行等具有重要意義。Fig．1Stru
4、ctureofuniconazole目前，烯效唑殘留檢測主要采用氣相色譜法和高效液相色譜法【6~。儀器分析法具有準確可靠等優(yōu)點，但需要比較昂貴的設備、專業(yè)化的實驗室和訓練有素的專門人才，對樣品前處理的要求高，難以適應大量樣本和現(xiàn)場快速檢測的要求。酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)具有特異性強、靈敏度高、樣品容量大、分析成本低、樣品前處理步驟簡便等特點，在大量樣本和現(xiàn)場樣本快速篩選監(jiān)測中顯示出獨特優(yōu)勢。本研究應用本實驗室制備的對烯效唑具有特異性親和力的抗體，采用包被抗體、酶標記半抗原直接競爭模式，在優(yōu)化條件下，建立了烯效唑的ELISA法，并用于蘋果中烯效唑的測定，簡化了樣品前處
5、理和操作步驟，縮短了檢測時問，實現(xiàn)了高靈敏度、高特異性的快速檢測。同時采用高效液相色譜一紫外檢測(HPLC—UVD)法進行了對比分析，結果滿意。2實驗部分2．1儀器、試劑與材料高效液相色譜儀(美國Waters公司)；PrimoR高速冷凍離心機(德國Heres公司)；Model680酶標儀(美國BIO—RAD公司)；DK-S28電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；Tappets單道可調移液器：5～50L，20~200L，100～1000L(芬蘭)，Transferpettte-8道可調移液器(德國)；96孔酶標板(浙江黃巖)；XW-80A旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠
6、)；YXQ．SG41．280手提式壓力蒸汽滅菌器(上海華線醫(yī)用核子有限公司)；攪拌機(廣東美的精品電器制造有限公司)。2012-02—15收稿；2012-05—22接受本文系863專題課題(No．2009AA03Z331)和國家自然科學基金(No．20777064)資助項目E-mail：szliu@yzu．edu．cn第11期張良等：直接競爭酶聯(lián)免疫吸附一高效液相色譜法測定烯效唑烯效唑(Uniconazole)：有效成分含量91．5％(鹽城利民農化有限公司)；抗烯效唑抗體：本實驗室以烯效唑衍生物與BSA偶聯(lián)制備人工抗原免疫制備多克隆抗體；烯效唑酶標半抗原：本實驗室制備；包被
7、液：0．02mol／L磷酸鹽緩沖液(PB，pH6．8)；封閉液：本實驗室制備；反應液：O．02mol／LPBS(pH6．8，含0．15mol／LNaC1)；洗滌液：滅菌蒸餾水；顯色液A：120mg過氧化脲溶于1000mL檸檬酸一磷酸鹽緩沖液(5．2g檸檬酸、8．4gNa：HPO溶于滅菌水，并定容至1000mL)；顯色液B：200mg3，3，5，5，_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于20mLN，N一二甲基甲酰胺(DMF)，用檸檬酸一磷酸鹽緩沖液定容至1000mL；臨用前將A液和B液按體積比1：1混勻；終止液：2mol／LH
