B16黑素瘤細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法.doc

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1、細(xì)胞傳代培養(yǎng)一．儀器的清洗與消毒（一）實(shí)驗(yàn)材料儀器：倒置顯微鏡、96孔板、微量移液器（槍及槍頭）、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、牛皮紙、棉線、培養(yǎng)平皿、噴壺、脫脂棉、封口膜、培養(yǎng)瓶100ml、點(diǎn)滴瓶(250ml、500ml)、燒杯（500ml、50ml）、量筒（500ml，100ml，10ml），濾器及濾膜（0.22um）酒精燈、移液管、吸球、吸管架及瓶架、鑷子、標(biāo)簽貼、液氮罐或冰箱冰柜、雙蒸器、超凈臺(tái)、細(xì)胞凍存管試劑：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS液、75%酒精(二)清洗消毒方法1.玻璃儀器（1）新玻璃儀器1

2、%稀鹽酸浸泡過(guò)夜——自來(lái)水沖洗（5-6次）——洗滌劑清洗——自來(lái)水沖洗（5-6次）——甩干——浸酸（瓶?jī)?nèi)不能有氣泡）過(guò)夜——自來(lái)水沖洗（20次）——蒸餾水洗（3-5次）——雙蒸水洗（3次）——烘干5（0-60攝氏度）——牛皮紙包裝（2）用過(guò)的玻璃儀器自來(lái)水浸泡——洗滌劑刷洗（以后同新儀器清洗步驟一樣）2.瓶蓋洗滌劑刷洗——自來(lái)水沖洗——蒸餾水浸泡過(guò)夜——雙蒸水煮沸2-3次1次/10/min——烘干——牛皮紙包裝3.剪刀鑷子洗滌劑刷洗——自來(lái)水沖洗——蒸餾水沖洗——酒精棉球擦拭（用雙蒸水與酒精配制）——牛皮紙包裝4.試劑的除菌使

3、用0.22um微孔濾膜除菌，可以除去細(xì)菌及2/3的支原體。二．實(shí)驗(yàn)方法取小鼠B16黑素瘤細(xì)胞株，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10ml，在37攝氏度5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞生長(zhǎng)至將近鋪滿培養(yǎng)瓶底部時(shí)，停止培養(yǎng)；棄去培養(yǎng)液，用PBS液清5ml洗細(xì)胞2次，棄去PBS液；用含0.25%的胰蛋白酶1ml消化細(xì)胞,于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞收縮變圓時(shí)拿回操作臺(tái)；瓶外用酒精棉球消毒，打開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋，倒去消化液（先倒去的先吹打），酒精棉球吸去最后一滴消化液，蓋上瓶蓋放置2-3min。打開(kāi)準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基、帶吸球的移液管，加培養(yǎng)基2

4、0ml，對(duì)著細(xì)胞面加入，加的時(shí)候吸管口不可碰到培養(yǎng)瓶口，加完后進(jìn)行吹打，注意不要有太多氣泡，吹打成單細(xì)胞懸液（一般基本5-7次），吹打完成后可取少量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；一般情況下，細(xì)胞長(zhǎng)的較快，一瓶可以分成3瓶。打開(kāi)經(jīng)過(guò)消毒的瓶子，分裝，蓋上瓶蓋，并標(biāo)記是由哪一瓶分出來(lái)的（什么細(xì)胞、時(shí)間等），用封口膜封好，在倒置顯微鏡下觀察后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)后2h觀察一次，以后每天觀察一次，一般3天完成一次傳代培養(yǎng)。傳至5代是就要進(jìn)行冷凍一次。