ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線分析及應(yīng)用.pdf

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1、ELISA技術(shù)在檢測(cè)中的應(yīng)用及數(shù)據(jù)分析軟件應(yīng)用劉平2010.3.12目錄?ELISA技術(shù)基本原理?ELISA技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用?ELISA試劑盒數(shù)據(jù)分析?標(biāo)準(zhǔn)曲線?分析軟件的詳細(xì)介紹和數(shù)據(jù)判定經(jīng)驗(yàn)分享1ELISA原理?ELISA的定義?ELISA的類型?ELISA技術(shù)的特性?ELISA技術(shù)必備的幾個(gè)基本試劑ELISA中常用名詞?半抗原?靈敏度?抗原?精密度?載體?檢測(cè)限?抗體?定量限?穩(wěn)定性?半定量?特異性?標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性?IC50?準(zhǔn)確度2食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用?在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物的藥物和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)

2、爭(zhēng)抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)即可得出樣本中藥物的殘留量。檢測(cè)項(xiàng)目?獸藥殘留抗生素分析；如氯霉素、硝基呋喃類、四環(huán)素類等。?有害添加物；如孔雀石綠、結(jié)晶紫、吊白塊、三聚氰胺等。?毒素；如生物毒素、食源性致病菌、細(xì)菌毒素、真菌毒素等。?微生物：如沙門氏菌、李斯特氏菌、致病性弧菌、彎曲桿菌等。?激素：如已烯雌酚、睪酮等?農(nóng)藥殘留?轉(zhuǎn)基因食品?食品過敏原?其他3ELISA檢測(cè)流程先后加加混勻洗板拍HSO干24先A液B液后加加酶顯色洗酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶板酶酶酶酶酶酶酶

3、酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶酶注意事項(xiàng)?實(shí)驗(yàn)前?實(shí)驗(yàn)中?實(shí)驗(yàn)后4數(shù)據(jù)分析?結(jié)果判定有三種方法，簡(jiǎn)單判定可用第1種方法，粗略判定可用第2種方法，定量判定用第3種方法。注意樣本吸光值與藥物的含量成負(fù)相關(guān)。判定方法一標(biāo)準(zhǔn)1樣本1的顯色情況可以看標(biāo)準(zhǔn)2出大概在標(biāo)準(zhǔn)2與標(biāo)準(zhǔn)1的標(biāo)顏色之間，即可得出其樣準(zhǔn)本中的待測(cè)物含量在標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)31與標(biāo)準(zhǔn)2之間，再乘上樣顯本的稀釋倍數(shù)以后即可得色標(biāo)準(zhǔn)4出該樣本的最終含量范圍。情況標(biāo)準(zhǔn)5同理可以看出樣本的標(biāo)準(zhǔn)6檢測(cè)含量在標(biāo)準(zhǔn)5與標(biāo)準(zhǔn)6的濃度之間，樣本1再乘上樣本的稀釋倍數(shù)以后即得到該樣本樣本2的大概含量。5判定方法二?

4、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。例如樣本1的吸光度值為0.236，樣本2的吸光度值為0.666，標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值分別是：0ppb為1.949；0.05ppb為1.434；0.15ppb為0.939；0.45ppb為0.487；1.35ppb為0.157；4.05ppb為0.060。則樣本1的濃度范圍是0.45ppb-1.35ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中藥物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是0.15ppb-0.45ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中藥物殘留的濃度范圍。判定方法三百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或

5、樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值（%）＝（B/B0）×100%標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以被檢測(cè)藥物的標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中藥物的實(shí)際濃度。6坐標(biāo)軸標(biāo)準(zhǔn)曲線?S形曲線：是典型劑量反應(yīng)曲線，多見于劑量－質(zhì)反應(yīng)關(guān)系中，分為對(duì)稱S形曲線和非對(duì)稱S形曲線兩種形式。?直線：化學(xué)物質(zhì)劑量的變化與反應(yīng)的改變成正比。?拋物線

6、：為一條線陡峭后平緩的曲線，類似于數(shù)學(xué)中的對(duì)數(shù)曲線，又稱為對(duì)數(shù)曲線型。7擬合曲線?用于免疫檢測(cè)的所謂“標(biāo)準(zhǔn)曲線”其實(shí)稱為擬合曲線比較合適。免疫檢測(cè)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)（可以是倍比稀釋的，也可以不是）濃度如果和相應(yīng)的吸光度（OD）值如果能夠呈現(xiàn)直線關(guān)系當(dāng)然是最理想的了，這時(shí)可以通過EXCEL等方便的獲得擬合曲線，進(jìn)而推算出樣品的濃度值。但我們做免疫檢測(cè)很少有時(shí)候能夠有這么理想的情況，標(biāo)品濃度和相應(yīng)OD值往往是"S"型的曲線關(guān)系，這時(shí)就不能用直線擬合的方式了，而對(duì)擬合方法進(jìn)行選擇就是必要的了。曲線擬合方式?關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方式，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對(duì)數(shù)

7、等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但都只適用于曲線的一部分，有的適用于前半段，有的適用于后半段，有的適用于中間一段，而Logistic曲線則對(duì)曲線的全部都有較好的適用性。當(dāng)然，如果用于定量，還是在中間一段較好。這些方法雖然沒有一種方法可以通用，但也都可以用。關(guān)鍵在于你的標(biāo)準(zhǔn)曲線做到了S形的哪一部分，你想檢測(cè)的樣品濃度在曲線的哪一部分。在S曲線的低濃度部分可以用乘冪方程很好的擬合，中低濃度部分可以用直線方程，中間部分可用對(duì)數(shù)方程，而中后段可用四參數(shù)。8生物學(xué)采用擬合方式?目前國際上最流行的免疫檢測(cè)擬合方式是“四參數(shù)邏輯擬合”，用這種擬

8、合方式往往能夠比較精確的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系，從而進(jìn)一步比較正確的獲得樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度值。?其實(shí)，