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《酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn).pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)的基本原理方法類型及反應(yīng)原理、、、試劑制備、試劑制備和和和臨床意義酶免疫技術(shù)是三大經(jīng)典標(biāo)記免疫技術(shù)之一，是以酶標(biāo)記抗體或抗原為主要試劑的一種標(biāo)記免疫分析技術(shù)。隨著相關(guān)新技術(shù)的不斷問世，如雜交瘤單克隆抗體技術(shù)（使各種對(duì)抗原決定簇高度特異的單克隆抗體可以在體外批量生產(chǎn)）、生物素－親和素放大系統(tǒng)的應(yīng)用以及與化學(xué)發(fā)光和電化學(xué)發(fā)光技術(shù)的偶聯(lián)等，明顯地提高民分析和測(cè)定方法的特異性、靈敏度及其自動(dòng)化程度，使酶免疫技術(shù)不斷更新，應(yīng)用范圍不斷拓寬。當(dāng)前，酶免疫技術(shù)已與形式各異、各具特點(diǎn)和用
2、途的定位、定量和超微量測(cè)定的標(biāo)記免疫分析技術(shù)融合發(fā)展，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的應(yīng)用日益廣泛，是取代放射免疫技術(shù)的主要方法之一。酶免疫技術(shù)的特點(diǎn)酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記抗原或酶標(biāo)記抗體為主要試劑，通過復(fù)合物中的酶催化底物呈色而對(duì)被測(cè)物進(jìn)行定性或定量的標(biāo)記免疫技術(shù)?；驹硎牵簩⒚概c試劑抗原或抗體用交聯(lián)劑結(jié)合起來，此種酶標(biāo)記抗原或抗體與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生特異反應(yīng)，并牢固結(jié)合，在加入相應(yīng)的酶的底物時(shí)，底物被酶催化生成呈色產(chǎn)物，在免疫組化染色時(shí)可指示待測(cè)反應(yīng)物的存在和定位，在酶免疫測(cè)定中，則可根據(jù)呈色物的有無和呈色深淺作定性或定量觀察。由于此技術(shù)是建立在抗原抗體反應(yīng)和酶的高
3、效催化作用的基礎(chǔ)上，故而該技術(shù)具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)，而且，可與其他技術(shù)偶聯(lián)而衍生出適用范圍更廣的新方法。①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某重酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。③標(biāo)本中的抗原或抗體、標(biāo)記抗原或抗體能按一定的次序與固相載體表面的抗體或抗原反應(yīng)，并通過底物與酶的反應(yīng)來反映標(biāo)本中的抗原或抗體的量。酶免疫技術(shù)的分類：：：一一一、一、、、按檢測(cè)對(duì)象的不同一般分為兩類按檢測(cè)對(duì)象的不同一般分為兩類：：：1.酶免疫組織化學(xué)技術(shù)（enzymeimmunohistochemistry
4、,EIH）:用于檢測(cè)組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原或抗體。2.酶免疫測(cè)定技術(shù)(enzymeimmunoassay,EIA):用于檢測(cè)體液樣本中可溶性抗原或抗體。二二二、二、、、根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物，，，可分為，可分為：：：1.均相法（homogenous）：不需要分離結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物，直接進(jìn)行測(cè)定。2.異相法(heterogenous)：需要分離結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物后才能進(jìn)行測(cè)定。酶免疫組化酶免疫技術(shù)均相酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)固相酶免疫測(cè)定定異相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定必備試劑：：：
5、①固相抗原或抗體------免疫吸附劑②酶標(biāo)記的抗原或抗體------酶結(jié)合物③酶反應(yīng)的底物------底物酶聯(lián)試劑陽性對(duì)照酶標(biāo)記物顯色液A終止液反應(yīng)板顯色液B濃縮洗滌液加樣槍與吸頭陰性對(duì)照雙抗體夾心法，屬于非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。它是檢測(cè)抗原最常用的ELISA，適用于檢測(cè)分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測(cè)。工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對(duì)于待測(cè)抗原是過量的,因此復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原的含量成
6、正比(在方法可檢測(cè)范圍內(nèi))。測(cè)定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測(cè)抗原含量。若固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)不同的抗原決定簇結(jié)合，則屬于雙位點(diǎn)夾心法。若采用固相載體上的抗原和酶標(biāo)抗原分別與樣品中被檢測(cè)抗體分子結(jié)合，則是雙抗原夾心法?！静僮鞑襟E】雙抗原夾心法，屬于非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。它是檢測(cè)抗體的ELISA。工作原理是：利用連接于固相載體上的抗原和酶標(biāo)抗原分別與樣品中被檢測(cè)抗體分子上兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗原和酶標(biāo)抗原的量相對(duì)于待測(cè)抗體是過量的,因
7、此復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體的含量成正比(在方法可檢測(cè)范圍內(nèi))。測(cè)定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測(cè)抗體含量。若采用固相載體上的抗原和酶標(biāo)抗原分別與樣品中被檢測(cè)抗體分子結(jié)合，則是雙抗原夾心法。雙抗原夾心法-操作步驟：：：⑴將特異性抗原包被固相載體。孵育一定時(shí)間，使形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原和雜質(zhì)。⑵加待檢標(biāo)本，孵育，使標(biāo)本中的抗體與固相載體上的抗原充分反應(yīng)，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。⑶加酶標(biāo)抗原，孵育，使形成固相抗原-待測(cè)抗體-酶標(biāo)抗原夾心復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合酶標(biāo)抗原。⑷加底物顯色。固相上的酶催
8、化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物,通過
