生物酶工程課件.ppt

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1、AdvancedEnzymeEngineering第九章生物酶工程Contents一、生物酶工程的定義二、生物酶工程的內(nèi)容三、生物酶工程的前景GoGoGo生物酶工程是酶學(xué)和以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，亦稱高級酶工程(AdvancedEnzymeEngineering)。一、生物酶工程1.定義二、生物酶工程的內(nèi)容（3）從蛋白質(zhì)或基因水平上設(shè)計，合成酶雜合體或自然界不曾有的酶（雜合酶）。生物酶工程主要包括：（1）用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶）；（2）修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶）；（4）抗體酶；（5）核酶。通過基因工程手段，克隆各種天

2、然酶的基因，將其克隆到表達載體中，然后將表達載體轉(zhuǎn)化到適當?shù)乃拗髦?，得到表達特定酶的基因工程菌，通過基因工程菌的繁殖大量產(chǎn)生的酶稱為克隆酶。1.克隆酶（1）克隆酶的定義：克隆酶圖例基因工程菌載體宿主生物體發(fā)酵克隆酶酶基因外源基因轉(zhuǎn)入微生物宿主細胞內(nèi)，與宿主細胞的遺傳物質(zhì)相結(jié)合，后代宿主的遺傳物質(zhì)中含有外源基因，這種帶上人工賦予的新的遺傳特性的宿主微生物，被稱為基因工程菌。2.基因工程菌的定義（1）在宿主細胞內(nèi)可以自主復(fù)制；（2）克隆酶對載體的要求（2）容易引入受體細胞；（3）具有合適的篩選標記基因；（4）具有少數(shù)限制性酶切位點。（3）克隆酶對宿主的要求（1）安全

3、可靠，非致病菌；（3）有利于酶的分離和純化；（5）容易培養(yǎng)和管理。（4）能利用廉價的原料，發(fā)酵周期短，產(chǎn)量高；（2）外源基因在宿主內(nèi)能夠表達且不被分解；（4）克隆酶基因的表達系統(tǒng)原核生物的基因表達系統(tǒng)真核生物的基因表達系統(tǒng)1.酵母表達系統(tǒng)2.植物表達系統(tǒng)3.動物表達系統(tǒng)4.絲狀真菌表達系統(tǒng)纖維素酶基因工程菌的構(gòu)建（5）克隆酶實例纖維素酶纖維素酶在食品、飼料、造紙、紡織等行業(yè)具有廣泛的用途。但由于天然纖維素酶產(chǎn)量低、來源有限而導(dǎo)致其大規(guī)模應(yīng)用受到限制。纖維素酶（cellulase）是能將纖維素水解為葡萄糖等簡單糖類的一組酶的總稱。為此，通過基因工程技術(shù)，克隆福壽螺

4、體內(nèi)的纖維素酶基因，構(gòu)建含有cel的基因工程菌，以期通過液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)的方式得到大量的克隆纖維素酶。afp基因轉(zhuǎn)化受體低溫篩選技術(shù)路線1A.bgpdL.egpdV.vgpd+表達載體PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化電激轉(zhuǎn)化分子鑒定原生質(zhì)體或菌絲球建立轉(zhuǎn)化體系低溫篩選體系建立技術(shù)路線2Cel基因工程菌株的篩選液體發(fā)酵分離純化定義：利用有控制地對天然酶基因進行剪切、修飾或突變，從而改變這些酶的催化特性、底物專一性或穩(wěn)定性，使之更加符合人們的需要。2.突變酶遺傳修飾改變酶的性能大致有：（1）提高酶的活性（2）提高酶的穩(wěn)定性（3）改變底物專一性（4）改變酶的最適pH值（

5、5）改變酶對輔酶的要求（6）改變酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)能力修飾酶基因的方法主要方法（i）定位突變（ii）體外定向進化定位突變（site-directedmutagenesis）是根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)、功能和作用機制的信息，在基因水平上精確改變酶分子中的氨基酸殘基，對酶的性質(zhì)和其催化特性進行改造，產(chǎn)生符合特定需要的酶。（i）定位突變盒式誘變寡聚苷酸引物誘變PCR誘變方法：（1）盒式誘變原理：利用一段人工合成的具有突變序列的寡聚核甘酸片段（寡核甘酸盒，OligonucleotideCassette），取代野生型基因中的相應(yīng)序列。HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI+（2）

6、寡聚苷酸引物誘變原理：用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核甘酸短片段作為引物，啟動單鏈DNA分子進行復(fù)制，生產(chǎn)出來的新鏈中目的基因的特定位點具有已經(jīng)發(fā)生突變的堿基序列。A轉(zhuǎn)化GTAGAATCGCTTCTACTAGGCTAP標記篩選分離突變體（3）PCR誘變定點誘變法大引物誘變法特點：可以在DNA區(qū)段的任何部位產(chǎn)生定點突變。原理：在頭兩輪的PCR反應(yīng)中，應(yīng)用兩個互補的并在相同部位具有相同堿基突變的內(nèi)側(cè)引物，擴增形成兩條有一端可彼此重疊的雙鏈DNA片段，兩者在其重疊區(qū)段具有同樣的突變。故此兩條雙鏈DNA片段經(jīng)變性和退火處理，形成兩種不同形式的異源雙鏈分子。然后選用兩個外測

7、寡核甘酸引物進行第三輪PCR擴增，可得到一種含有突變位點的突變體DNA。5’3’5’3’靶DNA片段5’5’3’3’混合、變性、退火定點誘變法5’3’5’3’大引物誘變法5’5’3’3’大引物PCRPCRPCR多次循環(huán)PCR一．理論來源利用基因工程原理可以在實驗室中模擬生物進化過程化學(xué)進化生物進化（ii）體外定向進化人為地創(chuàng)造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外對基因進行隨機突變，從一個或多個已經(jīng)存在的親本酶（天然的或者人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個人工突變酶庫，通過一定的篩選或選擇方法最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進化酶的分子進化技術(shù)稱

8、為體外定向進化。體外定向