生物技術(shù)制藥 重點(diǎn)

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1、分離純化酶的一般程序l粗酶液的制備：材料的選擇，發(fā)酵液處理，細(xì)胞破碎及酶的抽提l酶的初步分離：鹽析，等電點(diǎn)沉淀，有機(jī)溶劑沉淀，離心分離l酶的高度純化（酶的精制）：層析法（凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析及親和層析），電泳（等電聚焦電泳）l濃縮干燥及結(jié)晶：透析，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，超濾，冷凍干燥粗酶液的制備1、細(xì)胞破碎（機(jī)械、物理、化學(xué)、酶解）2、酶的抽提（酸堿、鹽溶液、有機(jī)溶劑）酶的主要分離技術(shù)1離心分離2沉淀分離（等電點(diǎn)沉淀法，鹽析法，有機(jī)溶劑法）3膜分離（超濾，透析）酶的主要純化技術(shù)－層析技術(shù)離子交換層析ionexchangechromatography凝

2、膠過濾層析gelfiltration疏水層析hydrophobicchromatography親和層析affinitychromatography區(qū)別離子帶不同電荷的蛋白質(zhì)與固定相的吸附洗脫能力不同凝膠分子大小，相對分子量疏水蛋白的疏水集團(tuán)與固定相的疏水配基吸附能力不同親和根據(jù)生物分子與特定的固相化配基（ligand）之間的親和力而使生物分子得到分離的方法凝膠層析的原理凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當(dāng)含有不同分子大小的組分的樣品進(jìn)入凝膠層析柱后，各個(gè)組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴(kuò)散，組分的擴(kuò)散程度取決于

3、孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴(kuò)散到孔穴內(nèi)部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動(dòng)相向下流動(dòng)，它們經(jīng)歷的流程短，流動(dòng)速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，經(jīng)歷的流程長，流動(dòng)速度慢，所以最后流出；生物傳感器的概念由生物識別物質(zhì)（如酶、微生物、動(dòng)植物組織、抗體等）和能量轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器，可以簡便快速的測定各種特異性很強(qiáng)的物質(zhì)生物傳感器的一般結(jié)構(gòu)與工作原理結(jié)構(gòu):有兩個(gè)部分組成1生物分子識別元件（感受器）：酶、核酸、抗體、細(xì)胞等2信號轉(zhuǎn)換器（換能器）：電化學(xué)電極、光學(xué)檢測元件、熱敏電阻、表面

4、等離子共振器件等工作原理：待測物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散作用進(jìn)入生物傳感器,通過分子識別發(fā)生特異的生物化學(xué)反應(yīng),產(chǎn)生的生化信號經(jīng)換能器轉(zhuǎn)換為可定量和可處理的電信號,進(jìn)而可檢測出該物質(zhì)的濃度酶工程在醫(yī)療上的應(yīng)用藥用酶:消化酶類,抗炎癥類,心血管類,腫瘤用酶例淀粉酶。脂肪酶來源麥芽微生物，消化不良食欲不振疾病診斷:酶活檢測;分析試劑固定化酶制備藥物:抗生素,氨基酸改型抗體（reshapedantibody，RAb）亦叫“重構(gòu)抗體”，“CDR移植抗體（CDRgraftingantibody）”。它是利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V）中互補(bǔ)性決定區(qū)（complement

5、aritydeterminativeregion，CDR）的氨基酸序列改換成鼠源單抗CDR序列。特點(diǎn)：此種抗體可以使人單抗獲得鼠單抗的特異性又保持人源抗體的親和力改型抗體特點(diǎn)：比嵌合抗體人源性程度高，但親和力常常偏低。嵌合抗體（chimericantibody）特點(diǎn):是用人抗體的C區(qū)替代鼠的C區(qū)。效果:使鼠源性單抗的免疫原性明顯減弱，并可延長其在體內(nèi)的半衰期及改善藥物的動(dòng)力學(xué)。屬第一代人源化抗體（humanizedantibody，HAb）嵌合抗體的基本原理是從分泌某種鼠單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞基因組中分離并鑒定出重排的功能性鼠IgV區(qū)基因，經(jīng)基因重組

6、與人IgC區(qū)基因按一定方式相拼接，克隆到表達(dá)載體中構(gòu)建鼠/人嵌合的輕重鏈基因表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞表達(dá),制備特異性嵌合抗體單克隆抗體的制備基因工程抗體的制備基因工程抗體技術(shù)的基本操作是首先從雜交瘤或免疫脾細(xì)胞外周血、淋巴細(xì)胞等提取mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再經(jīng)PCR分別擴(kuò)增出抗體的重鏈及輕鏈基因，按一定的方式將兩者連接克隆到表達(dá)載體中，并在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸桿菌、CHO細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物中表達(dá)，并折疊成有功能的抗體分子，篩選出高表達(dá)細(xì)胞株，再用親和層析等手段純化抗體片段。HAT篩選原理HAT培養(yǎng)基H,Hy

7、poxanthin次黃嘌呤;A,Aminopterin氨基喋呤T,Thymidine胸腺嘧啶核苷由于變異的瘤細(xì)胞不具有次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶核苷合成DNA。而只能利用谷酰胺與尿核苷單磷酸合成DNA，這一途徑又被氨基蝶呤阻斷，瘤瘤融合細(xì)胞和未融合瘤細(xì)胞因不能合成DNA而死亡。脾脾融合細(xì)胞B淋巴細(xì)胞在這樣的組織培養(yǎng)條件下不能長期生長，幾天內(nèi)迅速死亡。由于骨髓瘤細(xì)胞都是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）缺乏株，脾細(xì)胞內(nèi)卻又這種酶，融合細(xì)胞可利用HGPRT酶，用次黃嘌呤和胸腺嘧啶合成DNA，并能

8、克服氨基蝶呤的阻斷，使雜交瘤細(xì)胞正常生長，大量繁殖被篩選出來。人單克隆抗體制備1EB病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞技術(shù)2人——