逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1.ppt

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1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體目前，多數(shù)研究集中在將外源基因插人到基因組的某個(gè)位置，以促進(jìn)或抑制某種特定基因的表達(dá)，這就要求有一種可以將外源基因引入機(jī)體細(xì)胞中的運(yùn)載工具，而逆轉(zhuǎn)錄病毒載體正是迎合了這種需要而產(chǎn)生的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的特性設(shè)計(jì)出的一種病毒表達(dá)載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種單鏈RNA病毒，它是能夠在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將RNA轉(zhuǎn)變成cDNA，再在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等蛋白酶作用下擴(kuò)增的一類病毒。一般來說，逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA基因組的核心部分都包括三個(gè)開放的讀碼結(jié)構(gòu)：gag一編碼病毒的核心蛋白、pol一編碼逆轉(zhuǎn)錄酶、env一

2、編碼病毒的被膜糖蛋白。應(yīng)用機(jī)理這種病毒表達(dá)載體是將gag、pol、env等三個(gè)基因的大部分或全部除去，由于沒有g(shù)ag、pol、env三個(gè)基因的存在而不能夠產(chǎn)生有感染性的病毒顆粒，因此，人們又設(shè)計(jì)出了一種特殊的包裝細(xì)胞株。這種包裝細(xì)胞株能夠表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒的全部蛋白，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在整合入宿主基因組后，可以與包裝細(xì)胞形成的病毒缺失蛋白重組成具有感染能力的病毒顆粒。將收集的病毒顆粒感染靶細(xì)胞就可以將目的基因整合到靶細(xì)胞染色體上，基因活性得到表達(dá)。而目的基因可以通過細(xì)胞分裂傳給下一代子細(xì)胞。永久穩(wěn)定地表達(dá)目的蛋白。應(yīng)用用于基因

3、治療外源基因表達(dá)基因治療逆轉(zhuǎn)錄病毒載體無疑是在基因治療中傳遞目的基因最有效的運(yùn)載工具，廣泛應(yīng)用于人類基因治療的研究中。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，攜帶所要表達(dá)的目的基因，可以用于基因相關(guān)疾病的檢測(cè)及治療。用于腺苷脫胺酶缺陷癥的治療1990年，W．FrenchAnderson在美國(guó)實(shí)施的第一例基因治療就是應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體治療腺苷脫氨酶缺陷癥(ADA)。腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥是一種嚴(yán)重的免疫缺陷癥，腺苷脫氨酶的缺乏可使T淋巴細(xì)胞因該酶缺乏后一些代謝產(chǎn)物的累積而死亡，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的聯(lián)合性免疫缺陷癥(SCID)。手術(shù)取得了良好的

4、效果，術(shù)后并沒有發(fā)現(xiàn)患者的不良反應(yīng)。用于癌癥的治療目前，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在癌癥治療方面被廣泛的研究，傳統(tǒng)的化療方法雖然能夠抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者的生命，但對(duì)患者的機(jī)體也有很大損害，因此，人們開始研究在分子水平上抑制或消滅癌細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在此方面具有著巨大的應(yīng)用潛力。劉穎斌等人將對(duì)癌細(xì)胞具有抑制作用的ANGPTL4基因與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相連，用脂質(zhì)體法將重組病毒粒子感染人肝癌細(xì)胞HepGz。結(jié)果顯示人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減緩，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所介導(dǎo)的人ANGPTL4基因轉(zhuǎn)移很可能是一種有效的肝癌基因治療方式。逆轉(zhuǎn)

5、錄病毒載體在后天獲得性遺傳疾病如艾滋病及其基礎(chǔ)性研究川，神經(jīng)系統(tǒng)疾病,等疾病的治療方面同樣有著巨大的應(yīng)用潛力，因此受到人們的廣泛研究。外源基因表達(dá)用于基因工程疫苗的研制逆轉(zhuǎn)錄病毒載體作為一種表達(dá)載體，可以整合到動(dòng)物細(xì)胞染色體上，不斷的表達(dá)其所攜帶的蛋白。應(yīng)用這一特性，將編碼主要致病基因的保護(hù)性抗原基因連接在載體上，使其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)蛋白，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體，為制備動(dòng)物基因工程亞單位疫苗、基因工程DNA疫苗的研制開辟了一條新的路徑。RNA干擾簡(jiǎn)單地說，RNA干擾是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。

6、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)可以長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)siRNA,從而實(shí)現(xiàn)基因的穩(wěn)定沉默。問題對(duì)環(huán)境條件要求高在不適條件下，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒會(huì)失去其感染能力，因此，保持逆轉(zhuǎn)錄病毒的存在最適條件是非常關(guān)鍵的。插入誘變逆轉(zhuǎn)錄病毒載體經(jīng)過包裝后產(chǎn)生的病毒插入到基因組中可引起基因突變。癌基因激活由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的插入，使原來存在于宿主染色體上的癌基因被激活，而引起癌癥.引起機(jī)體免疫反應(yīng)而被清除轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因治療最終會(huì)用于體內(nèi)，由于機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的免疫環(huán)境，有可能當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入體內(nèi)，在沒有整合到染色體上時(shí)就被清除。錯(cuò)配率高逆轉(zhuǎn)錄病

7、毒用于基因治療的另一個(gè)不利之處在于，其在逆轉(zhuǎn)錄過程中有很高的錯(cuò)誤率，這種逆轉(zhuǎn)錄過程錯(cuò)誤率可導(dǎo)致在基因治療過程中宿主細(xì)胞程序性死亡或基因突變。應(yīng)用前景目前，基因治療被越來越多應(yīng)用于疾病治療，而作為基因治療中不可或缺的目的基因運(yùn)載工具，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以其能夠穩(wěn)定，永久地整合到宿主染色體上，并穩(wěn)定表達(dá)目的基因，日益受到更多的科研工作者的關(guān)注。但由于目前我們所涉及的領(lǐng)域更多的還是體外研究，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于體內(nèi)治療時(shí)就會(huì)更多地涉及到應(yīng)用安全問題、載體產(chǎn)物問題、基因在寄主細(xì)胞中的表達(dá)控制問題等。如何提高病毒的感染效力，并持久穩(wěn)

8、定地表達(dá)目的基因是今后研究逆轉(zhuǎn)錄病毒載體應(yīng)用的一個(gè)重要內(nèi)容。在疾病疫苗研究方面，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特性，用相應(yīng)疾病的抗原基因構(gòu)建表達(dá)載體，同時(shí)，可以對(duì)載體進(jìn)行改造，減少機(jī)體對(duì)表達(dá)蛋白的免疫作用，提高目的基因的蛋白表達(dá)量。另外，國(guó)外已有學(xué)者將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體應(yīng)用于生殖細(xì)胞研究，其意義更加深遠(yuǎn)，也為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的研究打開了新思路，讓