中和試驗(yàn)步驟.doc

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1、中和試驗(yàn)步驟1、測(cè)定病毒TCID50/100μl2、制備細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度約為1×105個(gè)/mL，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl。置37℃CO2培養(yǎng)箱中，直至細(xì)胞長(zhǎng)至單層。3、血清滅活：將待檢測(cè)的血清放到56℃水浴30min（此時(shí)血清中的病原菌都已被滅活）。4、100TCID50/50μl病毒液或者200TCID50/25μl病毒液的制備，這兩者是等價(jià)的。100TCID50/50μl病毒液制備方法：計(jì)算已測(cè)定了TCID50/100μl的病毒原液稀釋至100TCID50/50μl的稀釋倍數(shù):lg100TCID50/50μl=-log100-log(100/50)=-2.3010

2、3得100TCID50/50μl=10-2.30103，假設(shè)病毒TCID50/100μl=10-6.3，則稀釋倍數(shù)=(100TCID50/50μl)÷(TCID50/100μl)=106.3÷102.30103≈9976倍。5、取一塊新的96孔板，1-10列每孔加50μl待檢血清原液，再用8道孔排槍加每孔100TCID50/50μl病毒液50μl，稍微吹打使血清與病毒液混均。11列先每孔加50μl維持液，再于11列的第一孔加50μl標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清往下作1:2、1:22至1:28倍稀釋。12列第1孔加標(biāo)準(zhǔn)陰性血清原液50μl，再加100TCID50/50μl病毒液50μl。

3、用維持液將100TCID50/50μl的病毒液作4次連續(xù)10倍稀釋，稀釋成10TCID50/50μl、1TCID50/50μl、0.1TCID50/50μl,依次加到第12列的3到6孔，每孔加50μl，再每孔加50μl維持液。將培養(yǎng)板置37℃CO2培養(yǎng)箱中和1h。1、將細(xì)胞長(zhǎng)至單層的培養(yǎng)板中的維持液倒掉，然后將上一步已中和1h的血清病毒液轉(zhuǎn)移到長(zhǎng)了單層細(xì)胞的培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)移的時(shí)候要小心，以免加的液體把細(xì)胞吹掉了。2、再每孔加150μl維持液，微量振蕩器上震蕩30s，混均。將培養(yǎng)板置37℃CO2培養(yǎng)箱中，96h后開始觀察記錄結(jié)果。(注：在第5步中，加血清和抗原的時(shí)候，加的體積最好大于50μ

4、l，不然第6步將中和的血清病毒液轉(zhuǎn)移到單層細(xì)胞上的總體肯定是小于100μl的。加了維持液后，最后的總體積是250μl。)