凝膠層析實(shí)驗(yàn)步驟及細(xì)節(jié).doc

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1、溫州大學(xué)第四屆生物學(xué)科實(shí)驗(yàn)技能大賽血清凝膠層析實(shí)驗(yàn)成績：實(shí)驗(yàn)過程＋實(shí)驗(yàn)結(jié)果＋實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)時(shí)間：5月6日（周日）8:50到10B正門集合，上午9:00至12:00左右分離器使用指導(dǎo)及凝膠裝柱。下午1:30開始血清離心操作及層析操作。實(shí)驗(yàn)前：身穿實(shí)驗(yàn)服，用蒸餾水清洗實(shí)驗(yàn)器具實(shí)驗(yàn)后：清理實(shí)驗(yàn)器具凝膠層析的實(shí)驗(yàn)步驟凝膠層析的實(shí)驗(yàn)步驟過程名稱實(shí)驗(yàn)步驟凝膠預(yù)處理8g葡萄糖膠G-25放入250mL燒杯中100mL蒸餾水（充分溶脹）小火煮沸1h（水快沒了就再加水）小心攪拌（不破壞凝膠的結(jié)構(gòu)）靜止、冷卻、傾棄蒸餾水加入PBS磷酸鹽緩沖液10mL輕輕攪拌至凝膠

2、懸起傾入10×1.0cm層析柱裝柱???將全部凝膠一次性都傾入柱內(nèi)（防止斷層），且液面接近凝膠面時(shí)，用螺旋夾將橡膠管夾緊，然后小心放松螺旋夾，使液體緩慢流出，到液體剛好流入凝膠面時(shí)，將螺旋夾再夾緊，裝柱工作完成。每分鐘4滴水出來（2/3）（防止壓得太緊）加樣???用膠頭吸管將柱中上方清液吸出，沿柱內(nèi)壁緩緩滴加重鉻酸鉀（黃色）和藍(lán)葡聚糖混合溶液，用膠塞封住上口。均勻加樣（4滴）洗脫???用生理鹽水洗脫液進(jìn)行洗脫。打開螺旋夾，使液體的流速達(dá)到6～7dpm（實(shí)際10～15dpm）。收集藍(lán)色的藍(lán)葡聚糖在下方，黃色的重鉻酸鉀在上方。收集3ml的試管一

3、個(gè)個(gè)放好，最后完全白色才結(jié)束實(shí)驗(yàn)。再生（不斷加蒸餾水洗滌）實(shí)驗(yàn)試劑和用品1.試劑Sephandex4B凝膠（凝膠顆粒）、5%重鉻酸鉀、5%藍(lán)葡聚糖、生理鹽水2.主要實(shí)驗(yàn)用具鐵架臺(tái)（滴定臺(tái)架）、凝膠柱（層析柱）<多孔板、篩板>（10×1.0cm）、螺絲夾、移液管、燒杯、膠頭滴管、試管（20個(gè)）、試管架、玻璃棒凝膠層析定義凝膠層析又稱凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。它的突出優(yōu)點(diǎn)是凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑。凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離的技術(shù)。凝膠是一種具有多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的分子篩。利

4、用這種凝膠分子篩對(duì)大小、形狀不同的分子進(jìn)行層析分離，稱凝膠層析。分子大小彼此相差25%的樣品，只要通過單一凝膠床就可以完全將它們分開。實(shí)驗(yàn)原理不同類型凝膠的篩孔的大小不同。如果將這樣的凝膠裝入一個(gè)足夠長的柱子中，作成一個(gè)凝膠柱。當(dāng)含有大小不同的蛋白質(zhì)樣品加到凝膠柱上時(shí)，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質(zhì)就要連續(xù)不斷地穿入珠子的內(nèi)部，這樣的小分子不但其運(yùn)動(dòng)路程長，而且受到來自凝膠珠內(nèi)部的阻力也很大，所以越小的蛋白質(zhì)，把它們從柱子上洗脫下來所花費(fèi)的時(shí)間越長。凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。因此，大的蛋白質(zhì)直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。凝膠

5、過濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決于要純化的蛋白質(zhì)分子量。凝膠柱的制備在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1小時(shí)即可達(dá)到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時(shí)間又可消毒。凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個(gè)帶有攪拌裝置的較大容器，柱內(nèi)充滿洗脫液，將凝膠調(diào)成較稀薄的漿頭液盛于柱頂?shù)娜萜髦?，然后在微微地?cái)嚢柘率鼓z下沉于柱內(nèi)，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應(yīng)的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時(shí)間，再開始流動(dòng)平衡，流速應(yīng)低于層析時(shí)所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千

6、萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質(zhì)來觀察色帶的移動(dòng)，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現(xiàn)歪曲、散亂、變寬時(shí)必須重新裝柱。凝膠柱的重復(fù)使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復(fù)使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應(yīng)將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測(cè)定。如果不再使用可將其回收，一般方法是將凝膠用水沖洗干凈濾干，依次用70%、90%、95%乙醇脫水平衡至乙醇濃度達(dá)90%以上，濾干，再用乙醚洗去乙醇、濾干、干

7、燥保存。濕態(tài)保存方法是凝膠漿中加入抑菌劑或水沖洗到中性，密封后高壓滅菌保存。