研究真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能的方法.docx

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1、研究真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能的方法研究啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能的方法主要有缺失、點(diǎn)突變和足跡法。在分析得到了啟動(dòng)子的功能序列后，還要弄清與之結(jié)合的蛋白質(zhì)及兩者間的相互作用。在研究真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能時(shí)，常采用下列方法。（1）卵細(xì)胞系統(tǒng)（oocytesystem）該方法是將DNA直接注射人爪蟾卵細(xì)胞的細(xì)胞核，分析和觀察RNA的轉(zhuǎn)錄情況。該方法的局限性在于試驗(yàn)條件受卵細(xì)胞內(nèi)條件的限制?？梢杂脕?lái)分析：DNA片段的特性，不能用于分析蛋白質(zhì)因子與DNA間的結(jié)合。（2）轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（transfectionsystem）將外源DNA

2、導(dǎo)人轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并使之表達(dá)。表達(dá)可分為瞬時(shí)表達(dá)（transientexpression）和整合表達(dá)（integrantexpression）。由于轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞內(nèi)完成的，可以看成是一種體內(nèi)試驗(yàn)系統(tǒng)。但外源基因又不是細(xì)胞所固有的，和細(xì)胞固有基因的表達(dá)尚有差別。使用多種宿主細(xì)胞，可提高該系統(tǒng)的應(yīng)用價(jià)值。（4）轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)（transgenicsystem）轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)將外源基因整合人動(dòng)物的生殖細(xì)胞，使外源基因在部分或全部組織中表達(dá)。該系統(tǒng)和轉(zhuǎn)染系統(tǒng)有一些相同的局限性，即外源基因常以多拷貝存在，整合的位置也和內(nèi)源性基因不同。（4

3、）體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（invitro?system）體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是一種經(jīng)典的方法。它應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄的方法，結(jié)合缺失突變和點(diǎn)突變，來(lái)篩選哪些序列是啟動(dòng)子的功能所必需的，哪些序列對(duì)啟動(dòng)子的功能有影響，以及哪些輔助因子對(duì)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子中的某一片段有何種作用。啟動(dòng)子研究的第一步是確定啟動(dòng)子的位置及長(zhǎng)度。主要方法是用缺失試驗(yàn)來(lái)確定啟動(dòng)子的上游邊界，即當(dāng)缺失影響轉(zhuǎn)錄始時(shí)，說(shuō)明該處就是啟動(dòng)子的上游邊界；用缺失試驗(yàn)結(jié)合重組試驗(yàn)來(lái)確定下游邊界。確定了啟動(dòng)子的位置后，可采用點(diǎn)突變來(lái)研究每個(gè)堿基在啟動(dòng)子中所起的作用。研究蛋白質(zhì)輔助因子與DNA（

4、啟動(dòng)子）的相互作用可采用DNase、足跡法、凝膠阻滯法和硫酸二甲酯方法等。