流式抗體及熒光染料的選擇課件.ppt

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1、流式抗體及熒光染料的選擇陳曉東產(chǎn)品技術(shù)專員抗原抗體反應(yīng)12流式抗體的選擇、熒光染料應(yīng)用2珈源醫(yī)學(xué)抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的原理抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)影響抗原抗體反應(yīng)的因素3珈源醫(yī)學(xué)抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？乖c抗體的特異性結(jié)合既會(huì)在體內(nèi)發(fā)生，亦可以在體外進(jìn)行，體外進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)習(xí)慣上稱作血清學(xué)反應(yīng)抗原表位與抗體高變區(qū)間的互補(bǔ)結(jié)合抗原表位與抗體高變區(qū)的溝槽分子表面的結(jié)合抗原抗體之間的結(jié)合力親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體物質(zhì)基礎(chǔ)4珈源醫(yī)學(xué)抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)特異性可逆性比例性階段性5珈源醫(yī)學(xué)特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性抗原抗體反

2、應(yīng)特異性示意圖分子基礎(chǔ):抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性6珈源醫(yī)學(xué)可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性影響因素：抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力－親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響－pH、離子強(qiáng)度7珈源醫(yī)學(xué)前帶(prezone)：抗體過(guò)量后帶(postzone)：抗原過(guò)量等價(jià)帶(equivalencezone)：抗原抗體比例合適抗原抗體反應(yīng)比例性示意圖比例性：抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系8珈源醫(yī)學(xué)階段性第一階段：特異性結(jié)合階段，反應(yīng)快，不可見(jiàn)第二階段：反應(yīng)可見(jiàn)階段，反應(yīng)慢，

3、出現(xiàn)凝集、沉淀和細(xì)胞溶解等現(xiàn)象9珈源醫(yī)學(xué)影響抗原抗體反應(yīng)的因素一、反應(yīng)物自身因素抗原:理化性狀、表位種類和數(shù)目抗體:來(lái)源、特異性、親和性、效價(jià)二、環(huán)境因素電解質(zhì):生理鹽水或緩沖液酸堿度:pH6～pH9（pH7.2～pH7.4）溫度:15℃～40℃（4℃），37℃最適10珈源醫(yī)學(xué)流式抗體的選擇、熒光染料應(yīng)用11珈源醫(yī)學(xué)RUOASRIVDⅡ類體外診斷試劑分析物特異性試劑僅用于研究12珈源醫(yī)學(xué)單克隆抗體混合單克隆抗體多克隆抗體熒光直標(biāo)的抗體未標(biāo)記的抗體（需要熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行間接標(biāo)記檢測(cè)）單分子熒光素復(fù)合分子熒光素13珈源醫(yī)學(xué)信噪比（S/N）：特異性熒光信號(hào)（

4、signal）與非特異性熒光信號(hào)的比值PE>APC>PE-Cy5>PerCP-Cy5.5>FITC>PerCPS/N越大，表明陽(yáng)性與對(duì)照細(xì)胞的熒光峰分離越好，當(dāng)S/N大于3時(shí)屬于可接受范圍14珈源醫(yī)學(xué)綜合因素：熒光標(biāo)記效率：抗體上標(biāo)記熒光素的數(shù)量（E/P比值）也會(huì)影響相對(duì)熒光強(qiáng)度?？贵w檢測(cè)的抗原密度：高密度的抗原幾乎可以用任何熒光素標(biāo)記的抗體檢測(cè)，而較低表達(dá)的抗原則需要用較高S/N比值的熒光素（如PE和APC）標(biāo)記的抗體檢測(cè)，從而達(dá)到有效區(qū)分陽(yáng)性細(xì)胞群和何陰性細(xì)胞群的目的。細(xì)胞自發(fā)熒光：檢測(cè)自發(fā)熒光水平高的細(xì)胞時(shí)，使用發(fā)射光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光染料（如APC）

5、可以得到較好的S/N比值。15珈源醫(yī)學(xué)理想熒光素具有高的光子產(chǎn)量，信號(hào)強(qiáng)度高對(duì)激發(fā)光有較強(qiáng)的吸收，降低背景信號(hào)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間距離較大，減少背景信號(hào)的干擾易與被標(biāo)記的抗原、抗體或其他生物物質(zhì)結(jié)合而不影響被標(biāo)記物得特異性穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、標(biāo)本抗凝劑和固定劑的影響16珈源醫(yī)學(xué)17珈源醫(yī)學(xué)18珈源醫(yī)學(xué)根據(jù)儀器選用熒光素：1.每個(gè)通道只能選擇1種熒光素2.各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配搭配的熒光素之間發(fā)射光譜重疊盡量小19珈源醫(yī)學(xué)注意：1.不要為了節(jié)省熒光抗體，未經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)就按抗體說(shuō)明書(shū)減半量甚至更多進(jìn)行標(biāo)記。2.不能完全憑感覺(jué)進(jìn)行標(biāo)記，需進(jìn)行細(xì)

6、胞計(jì)數(shù)。3.應(yīng)用FITC標(biāo)記抗體時(shí)，避免使用酸性緩沖溶液，因?yàn)镕ITC的熒光特性是pH依賴的。4.熒光抗體、熒光染色的樣本應(yīng)避免暴露于強(qiáng)光下。5.建議盡快上機(jī)檢測(cè)（最好24h內(nèi)）。20珈源醫(yī)學(xué)ThankYou!陳曉東產(chǎn)品技術(shù)專員21珈源醫(yī)學(xué)