第三章毛細(xì)管電泳法介紹課件.ppt

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1、第三章毛細(xì)管電泳法CapillaryElectrophoresis第一節(jié)毛細(xì)管電泳概述第二節(jié)毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)理論第三節(jié)毛細(xì)管電泳儀第四節(jié)毛細(xì)管電泳類型第五節(jié)毛細(xì)管電泳的應(yīng)用和進(jìn)展第一節(jié)毛細(xì)管電泳概述毛細(xì)管電泳（CE），又稱高效毛細(xì)管電泳，是近年來(lái)發(fā)展最快的高效分離分析技術(shù)之一。該技術(shù)是現(xiàn)代微柱分離技術(shù)和經(jīng)典電泳技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)等常用分離技術(shù)的重要補(bǔ)充，在諸多研究領(lǐng)域得到了人們廣泛的接受和認(rèn)可。一、毛細(xì)管電泳發(fā)展歷程1808年，俄國(guó)物理學(xué)家Pence發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1

2、937年，瑞典Tiselius將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定,第一次從人血清提取的蛋白質(zhì)混合液中分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白，但分離效率低；1981年，Jorgenson在75μm毛細(xì)管內(nèi)施加300V/cm的高強(qiáng)度電場(chǎng)，獲得了理論塔板數(shù)超過400,000plates/m的高分離效率，轟動(dòng)了整個(gè)分離界，成為CE劃時(shí)代里程碑1989年，毛細(xì)管電泳儀問世。1989年，第一屆CE國(guó)際會(huì)議的召開，標(biāo)志著一門新的分析技術(shù)的產(chǎn)生。二、毛細(xì)管

3、電泳的特點(diǎn)(1)高效：每米理論塔扳數(shù)低則十幾萬(wàn)，高則幾百萬(wàn)甚至上千萬(wàn)；(2)快速：可在十幾分鐘甚至幾十秒內(nèi)完成分離；(3)低樣品消耗：只需納升甚至皮升級(jí)樣品量；(4)低成本分析：只需低廉的分離毛細(xì)管和少量的運(yùn)行緩沖液；CE是現(xiàn)代微柱分離和經(jīng)典電泳技術(shù)有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物，具有較HPLC和平板凝膠電泳更多的優(yōu)點(diǎn)：(5)高度自動(dòng)化：CE是目前自動(dòng)化程度最高的分離分析方法之一；(6)潔凈：通常用水溶性緩沖液，對(duì)人體和環(huán)境無(wú)害；(7)多分離模式：可根據(jù)需要在同一儀器上選用不同的樣品分離模式；(8)應(yīng)用范圍廣：具有“萬(wàn)能

4、”分析的功能和潛力，既可以分析無(wú)機(jī)離子、氨基酸、藥物等小分子，又可以分析蛋白質(zhì)等生物大分子,甚至整個(gè)細(xì)胞和各種微粒。第二節(jié)毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)理論+—一、電泳流電泳：在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象。電泳時(shí)，不同離子在電場(chǎng)中具有不同的定向遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？淌度(μ）：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)下的電泳速度。絕對(duì)淌度：在無(wú)限稀釋溶液中測(cè)得的淌度。有效電泳淌度：在實(shí)際溶液中測(cè)得的淌度。+—電場(chǎng)強(qiáng)度：與所施加的電壓成正比，與兩電極間的距離（L）成反比

5、E=V/L電場(chǎng)力：在溶液中，電場(chǎng)對(duì)帶電離子作用力（F）的大小等于帶電離子所帶的凈電荷（q）與電場(chǎng)強(qiáng)度的乘積：F=q·E在電泳遷移過程中，介質(zhì)粘滯力（F’）必然會(huì)阻礙離子的遷移。粘滯力的大小與離子大小、形狀、緩沖液粘度、甚至電泳介質(zhì)孔徑均有關(guān)系，與帶電離子的移動(dòng)速度更是直接相關(guān)。對(duì)于球形分子F’的大小服從Stokes定律：F’=6πηrνefη：緩沖液粘度；r：球形分子的半徑；νef：離子在電場(chǎng)中的遷移速度。當(dāng)帶電離子以速度ν在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用，此時(shí)F=F

6、’故：q·E=6πηrνef則離子在電場(chǎng)中的遷移速度：即帶電離子的電泳遷移速率（或稱電泳淌度）:由此可知，球形帶電離子的遷移率，主要取決于自身狀態(tài)，即與其所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。電泳過程中正是利用帶電離子電泳遷移速度或遷移速率的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。二、電滲流在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，形成電滲流。石英毛細(xì)管柱，內(nèi)壁大約有8.31?mol/m2的硅醇基（Si-OH），其等電點(diǎn)約為1.5，內(nèi)充液pH>

7、3時(shí)，表面電離成SiO-，管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。1.CE中電滲流的大小與方向電滲流的大小可用電滲速度和電滲淌度表示。（1）電滲流的大小電滲流的大小與電場(chǎng)強(qiáng)度、Zata電勢(shì)及緩沖液介電常數(shù)有關(guān)，某一電泳體系內(nèi)電滲流的具體數(shù)值可以用Helmholtz-Smoluchowski公式計(jì)算：式中，為電滲速度；為電滲淌度（EOFmobility）；為雙電層的Zeta電位；為緩沖液介電常數(shù)；η為電解液粘度；V為所施加的電壓；為毛細(xì)管總長(zhǎng)度。在具體實(shí)驗(yàn)中，可根據(jù)需要選用不同的中性組分作為標(biāo)記物（N,N-二甲基甲酰胺

8、、二甲亞砜、甲酰胺、苯酚、丙酮等），測(cè)定不同緩沖條件下中性標(biāo)記物的遷移時(shí)間，按下述公式計(jì)算出電滲率：其中，t：中性標(biāo)記物的遷移時(shí)間，ldet為毛細(xì)管電泳有效長(zhǎng)度，ltot為毛細(xì)管電泳有效長(zhǎng)度。（2）CE中電滲流的方向石英毛細(xì)管帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：毛細(xì)管改性：表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)；加電滲流反轉(zhuǎn)劑:內(nèi)充液中加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽(yáng)極