第三章 吸附層析okppt課件.ppt

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1、第三章吸附層析主講：蘇應(yīng)娟教授吸附層析（色層法或色譜法）是一種分離純化方法1903年俄國植物學(xué)家茨維特首先將碳酸鈣細(xì)粉裝入玻璃管內(nèi)使其成柱形，然后把石油醚抽提的植物色素溶液倒入，讓其通過碳酸鈣柱，用石油醚洗滌，發(fā)現(xiàn)柱上端是黃色，較下端是綠色，各種色層彼此分開，這就是早期的層析。層析方法可根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)分類：按流動相分類，有液相層析和氣相層析按固定相“床”的形式分類，有柱層析、薄板（層）層析、薄膜層析等第一節(jié)吸附柱層析固體吸附劑為固定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動相構(gòu)成柱狀的一種層析方法。常用的吸附劑：極性和非極性羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁和人造沸石一、常用術(shù)語1．固定相由層析基質(zhì)組成的：固

2、體物質(zhì)（如吸附劑、離子交換劑）液體物質(zhì)（如固定在纖維素或硅膠上的溶液）這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進(jìn)行可逆性的吸附、溶解和交換作用。2．流動相在層析過程中推動固定相上的物質(zhì)向一定方向移動的液體或氣體稱為流動相在柱層析時，稱洗脫劑或洗滌劑（即推動有效成分或雜質(zhì)向一定方向移動的溶液）在薄層層析時，又稱展層劑3.層析以基質(zhì)為固定相（柱狀或薄層狀），以液體或氣體為流動相，有效成分和雜質(zhì)在這兩個相中連續(xù)多次地進(jìn)行分配、吸附或交換作用，使混合物得到分離的過程。4.操作容量即在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反應(yīng)達(dá)到平衡時，存在于基質(zhì)上的飽和容量，一般以每克（或毫升）基質(zhì)結(jié)合某種成分的摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。其數(shù)

3、值大，表明基質(zhì)對某種成分的結(jié)合力強(qiáng)。否則反之。5．床體積（Vt）是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積（Vt）。Vt是基質(zhì)的外水體積（Vo）和內(nèi)水體積（Vi）以及自身體積（Vg）的總和。即Vt＝Vo+Vi+Vg6．外水體積（Vo）指基質(zhì)顆粒之間體積的總和7．內(nèi)水體積（Vi）是指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和8.基質(zhì)體積（Vg）基質(zhì)自身所具有的體積Vo、Vi、Vg都是隨著床體積和基質(zhì)性質(zhì)變化而變化的9．洗脫體積（Ve）是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達(dá)到最大值時的流動相體積。用Ve表示。10．膨脹度在一定溶液中，單位重量的基質(zhì)充分溶脹后所占有的體積。用Vβ表示。即每克溶脹基質(zhì)所具有的床

4、體積。一般親水性基質(zhì)的膨脹度比疏水性的大。11.分配系數(shù)和遷移率分配系數(shù)——指一組分在固定相與流動相中含量的比值，用K表示。遷移率——指一組分在相同時間內(nèi)，在固定相移動的距離與流動相移動距離之比值，用Rf表示。K值大，表明規(guī)定的組分對固定相結(jié)合力大，遷移率小。K值小，則結(jié)合力小，遷移率大。不同物質(zhì)的分配系數(shù)和遷移率是不一樣的。幾種物質(zhì)之間的分配系數(shù)或遷移率的差異程度是決定它們采用層析方法能否分離開的先決條件。其差異程度越大分離效果就越好。二、基本原理在吸附層析中，使用的固定相基質(zhì)是顆粒狀的吸附劑等物質(zhì)。在吸附劑的表面存在許多隨機(jī)分布的吸附位點(diǎn)，這些位點(diǎn)通過范德華引力和靜電引力與蛋白質(zhì)和核酸等生

5、物分子結(jié)合，其結(jié)合力的大小與各種生物分子的結(jié)構(gòu)和吸附劑的性質(zhì)有密切關(guān)系。如把含A、B兩種物質(zhì)的混合液加入層析柱，選適宜的洗脫劑，控制其流動速度，由于A，B兩種物質(zhì)對吸附劑結(jié)合力的差異性，將它們分離。假如吸附劑對A的結(jié)合力小于B時，則B留在柱子上部，A移至柱子的下部。A、B在柱上分離，是由于A、B在固定相（吸附劑）與流動相（洗脫劑）之間的分配系數(shù)不同，如果A物質(zhì)分配系數(shù)小于B物質(zhì)時，則A在柱上移動的速度大于B?；旌衔镌趯游鲋械姆蛛x過程，實(shí)質(zhì)上是吸附、解吸附、再吸附的連續(xù)過程，或是在固定相與流動相之間連續(xù)分配的過程。三、吸附劑1．吸附劑的選擇要求：表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)和成本

6、低廉等。選擇吸附劑：根據(jù)吸附劑本身和被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)。極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性的吸附劑易吸收非極性的物質(zhì)。但為了便于解吸附，對于極性大的分離物，應(yīng)選擇小的吸附劑。確定理想的吸附劑必需經(jīng)過多次的試驗(yàn)。2．吸附劑的性質(zhì)商品吸附劑購得即可使用。當(dāng)吸附劑混有某些雜質(zhì)或者顆粒不均勻時，使用前應(yīng)處理：先過篩，除去大的顆粒，或者采用懸浮法，除去細(xì)小顆粒，然后用酸、堿等溶液浸泡，接著用沸水煮，清水洗，再用有機(jī)溶液如甲醇處理，這樣即可得到既無雜質(zhì)，顆粒又均一的吸附劑。（1）羥基磷灰石[Ca5（PO4）3OH]（簡稱HA）分離磷酸蛋白質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：HA的吸附容量高，穩(wěn)定性好（在T＜85℃，pH5.

7、05-10.0均可使用）應(yīng)用：制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒；分離RNA、雙鏈DNA，單鏈DNA和雜型雙鏈DNA-RNA等。HA的Ca2+基團(tuán)和生物分子表面的負(fù)電荷基團(tuán)的相互反應(yīng)，在用HA分離生物分子過程中起著重要的作用。而HA的PO43-基團(tuán)與生物分子表面的陽電荷基團(tuán)的相互反應(yīng)，則僅起著次要的作用。注意：1）HA系干粉時，要先在蒸餾水中浸泡，使其膨脹度（水化后所占有的體積）達(dá)到2-3ml/g后