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1、ICS?65.020.20B16?????DB37山東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB37/T4101—2020?????蘋果輪紋病菌快速檢測方法Rapiddetectionofbotryosphaeriadothidea2020-08-31發(fā)布2020-10-01實(shí)施山東省市場監(jiān)督管理局???發(fā)布DB37/T4101—2020前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：王英姿、劉保友、汪少麗、王培松、石潔。4DB37/
2、T4101—2020蘋果輪紋病菌快速檢測方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）快速檢測蘋果輪紋病菌的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于蘋果葉片、枝條和果實(shí)中蘋果輪紋病菌的快速檢測。方法檢出限：10-7ng/μL蘋果輪紋病菌DNA。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682?分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403?實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范?食品分子生物學(xué)檢測3 原理3.1 擴(kuò)增原理根據(jù)蘋果輪紋病菌的ITS序
3、列中特異性序列設(shè)計(jì)特異性內(nèi)、外引物及環(huán)引物各一對(duì)，特異性序列參見附錄A。三對(duì)引物特異性識(shí)別靶標(biāo)序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，利用Bst酶啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在ITS基因序列啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物，加入顯色液即可通過顏色變化觀察判定結(jié)果。3.2 顯色液顯色原理SYBRGreenI是一種高靈敏度的DNA熒光染料，可以嵌入方式結(jié)合到雙鏈DNA的小溝內(nèi)。當(dāng)它與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，熒光信號(hào)是游離狀態(tài)的800～1?000倍。在不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，SYBR染料分子的熒光信號(hào)不發(fā)生改變，顏色顯現(xiàn)為橙色；當(dāng)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，
4、隨著雙鏈DNA的增加，SYBR染料的熒光信號(hào)也隨之大幅度增強(qiáng)，其信號(hào)強(qiáng)度可代表雙鏈DNA分子的數(shù)量，同時(shí)顏色由橙色變?yōu)榫G色。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。LAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatedisothermalamplification）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）ITS：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internaltranscribedspacer）2×LampMasterMix：等溫?cái)U(kuò)增PCR混合液Bst酶：BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）5 試劑和材料4DB37/T4101—2020除有
5、特殊說明外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。1.1 等溫?cái)U(kuò)增PCR混合液（2×LampPCRMasterMix1)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。)）：包含40?mmol/LTris-HCl、20?mmol/L(NH4)2SO4、20?mmol/LKC1（pH值為8.8）、16?mmol/LMgSO4、2.0?mmol/LdNTPs、0.2?%TrionX-100。1.2 BstDNA聚合酶：酶濃度
6、8?U/μL。1.3 顯色液：SYBRGreenI熒光染料，1?000×。1.4 引物：根據(jù)蘋果輪紋病菌ITS基因序列設(shè)計(jì)一套特異性引物，包括外引物1（F3），外引物2（B3），內(nèi)引物1（FIP），內(nèi)引物2（BIP），環(huán)引物1（LF）和環(huán)引物2（LB）。外引物擴(kuò)增片段長度：189?bp，引物序列見附錄A。1.5 DNA快速提取液：DNA-EZReagentsAll-DNA-Fast-Out2)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，給出這一信息是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效產(chǎn)品。)。1.6
7、 甜菜堿：5?mol/L。1.7 離心管：0.1?mL、1.5?mL。1.8 塑料研磨棒：長度70?mm，研磨頭外徑6.2?mm，研磨頭長度9.5?mm。2 儀器設(shè)備2.1 恒溫箱：滿足65?℃±3?℃、80?℃±1?℃要求。2.2 移液器：量程0.5?μL～10?μL，量程10?μL～100?μL，量程100?μL～1?000?μL。3 測定步驟3.1 試驗(yàn)設(shè)置3.1.1 陰性對(duì)照：采用不含有目標(biāo)基因序列的蘋果腐爛病菌（Valsamali）基因組DNA為模板。3.1.2 陽性對(duì)照：采用含有目標(biāo)基因序列的蘋果輪紋病菌（Botryosphaeriadothi
8、dea）基因組DNA為模板，濃度應(yīng)略高于方法檢出限。3.1.3 空
