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《生物工程下游技術(shù) 細(xì)胞分離與破碎ppt課件.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、Chapter2細(xì)胞分離與胞內(nèi)產(chǎn)物的溶解CellSeparationandExtractionoftheProductTrappedintheBiomass2.1細(xì)胞的分離2.2細(xì)胞的破碎2.2細(xì)胞破碎(cellmill）細(xì)胞破碎的目的由于有許多生化物質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)部，必須在純化以前將細(xì)胞破碎，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放到液相中，然后方可進行提取Insomecases,theproductsofinterestarenotinthebrothbutareinthebiomass.Itisintracellular.Releasingthistrappedmateria
2、lusuallyinvolvesrupturingthecellwall2.2細(xì)胞破碎(cellmill）2.2.1細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與組成2.2.2細(xì)胞破碎技術(shù)2.2.3目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放2.2.4破碎率的評價2.2.5包含體溶解與蛋白質(zhì)的復(fù)性2.2.1細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與組成革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌酵母真菌革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁革蘭氏陰性細(xì)胞壁酵母細(xì)胞壁細(xì)菌細(xì)胞壁化學(xué)組成肽聚糖糖：N-乙酰葡萄糖胺,N-乙酰胞壁酸,半乳糖胺氨基酸：D-丙氨酸L-丙氨酸D-谷氨酸L谷氨酸磷壁質(zhì)：聚核糖醇磷酸酯聚甘油磷酸酯糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖脂質(zhì):酵母與真菌成分糖及其氨基衍生物：葡萄糖
3、30%甘露糖30%半乳糖巖藻糖葡萄糖胺1-2%氨基酸谷氨酸5-7%天門冬氨酸脂質(zhì)1-13.5%葡萄糧胺與胞壁酸肽聚糖酵母細(xì)胞化學(xué)成分2.2.2細(xì)胞破碎技術(shù)原理：壓擠撞擊剪切化學(xué)滲透壓擠剪切化學(xué)滲透產(chǎn)物釋放2.2.2.1機械破碎高壓勻漿珠磨撞擊超聲高壓勻漿1)：結(jié)構(gòu)和原理—高壓勻漿器，由高壓泵和勻漿閥組成。見圖高壓勻漿2)影響破碎率的因素見圖2.123)適用范圍和操作注意點酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎，料液細(xì)胞濃度可達到20%左右，團狀和絲狀及小的G+菌不適。珠磨1)結(jié)構(gòu)與原理---見圖2)破碎率動力學(xué)方程式3)適用范圍和操作注意點大多數(shù)微生物的細(xì)胞破碎珠磨撞
4、擊撞擊聲頻高于15~20KHZ的超聲波在高強度聲能輸入下，利用空化現(xiàn)象(cavitation)引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞破碎。超聲波—氣泡形成—氣泡長大—破碎超聲波的聲頻、聲能、處理時間、細(xì)胞濃度及菌種類型均影響破碎效率。缺點：產(chǎn)生化學(xué)自由基團—氧化產(chǎn)物，且噪聲大。超聲波破碎(Ultrasonication)超聲破碎釋放方程2.2.2.2化學(xué)和生物化學(xué)滲透酸堿處理化學(xué)試劑酶溶物理滲透滲透壓沖擊法凍結(jié)融化法干燥法2.2.3目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放(1)僅破壞或破碎目標(biāo)產(chǎn)物的位置周圍(2)選擇性溶解目標(biāo)產(chǎn)物2.2.4破碎率的評價直接計數(shù)（1）計數(shù)器（2）平板計數(shù)（
5、3）顯微鏡間接計數(shù)（1）活性測定（2）電導(dǎo)率測定：破碎后，帶電荷的內(nèi)容物釋放，使懸浮液的導(dǎo)電率增加。2.2.5包含體溶解與蛋白質(zhì)的復(fù)性重組DNA技術(shù)實現(xiàn)了大規(guī)模生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì)，但這些基因重組所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)往往互相交聯(lián)在一起，形成不溶性的聚積物，稱包含體(inclusionbodies,Ibs)。2.2.5.2包含體的性質(zhì)2.2.5.3包含體的形成包含體的形成為動力學(xué)控制過程，可用競爭反應(yīng)動力學(xué)描述2.2.5.1包含體的概念U—伸展肽鏈(unfoldedpeptide);I—折疊中間態(tài)；N—天然活性態(tài)；A—聚集體(包含體)ki—中間體生成速率常數(shù);kr—折疊
6、速率常數(shù)；ka—聚集體生成速率常數(shù)U→I→N ↓ Akikrka1)在折疊反應(yīng)中，從伸展態(tài)到中間體的形成是非?？焖俚?，一般在毫秒范圍內(nèi)完成，但從中間體轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粦B(tài)的過程比較緩慢，是反應(yīng)的限速步驟。當(dāng)溶液中離子強度或變性劑濃度很低，又無其它輔助因子(如人工伴侶)存在時，聚集趨勢占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的自發(fā)復(fù)性效率極低。2)目前有兩種不同的假設(shè)：一種假設(shè)認(rèn)為，肽鏈中的局部肽段先形成一些構(gòu)象單元，如α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構(gòu)，然后再由二級結(jié)構(gòu)單元的組合、排列，形成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；另一種假設(shè)認(rèn)為，首先是由肽鏈內(nèi)部的疏水相互作用導(dǎo)致一個塌陷過程，然后經(jīng)逐步調(diào)整
7、，形成不同層次的結(jié)構(gòu)。3)當(dāng)溶液中離子強度或變性劑濃度很低，又無其它輔助手段存在時，聚集趨勢占主導(dǎo)地位，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的自發(fā)復(fù)性效率極低。細(xì)胞破碎--勻漿離心--回收包含體–加入變性劑溶解包含體--可溶性伸展態(tài)--除去變性劑--恢復(fù)天然構(gòu)象及活性2.2.5.4包含體的分離純化2.2.5.5蛋白質(zhì)的復(fù)性1)回收包含體后，加入變性劑溶解包含體，使之成為可溶性伸展態(tài)，再除去變性劑使表達產(chǎn)物折疊恢復(fù)天然構(gòu)象及活性。2)但在實際研究中發(fā)現(xiàn)，在體外折疊時，蛋白質(zhì)分子間由于存在大量錯誤折疊和聚合，復(fù)性效率往往很低。原因是蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)雖然由其氨基酸順序決定，然而伸展肽鏈折
8、疊為天然活性結(jié)構(gòu)的過程還受到周圍環(huán)境的影響。3)當(dāng)溶液中離子強度或
