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1、固定化技術(shù)在殼聚糖酶生產(chǎn)中應(yīng)用 摘要：以產(chǎn)酶活性與產(chǎn)酶穩(wěn)定性為指標(biāo)評價3種固定化細胞產(chǎn)殼聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.99）方法，以酶比活力、酶結(jié)合效率、酶活力回收率及穩(wěn)定性評價4種固定化殼聚糖酶方法，以篩選最優(yōu)固定化方案應(yīng)用于殼聚糖酶的生產(chǎn)。結(jié)果表明，海藻酸鈉殼聚糖包埋法固定化細胞的產(chǎn)殼聚糖酶活性較高且穩(wěn)定性好；海藻酸鈉殼聚糖吸附包埋固定化殼聚糖酶的酶比活力、酶結(jié)合效率與酶活力回收率均為最高，且穩(wěn)定性強。關(guān)鍵詞：固定化技術(shù)；殼聚糖；殼聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.99）；海藻酸鈉中圖分類號：Q556+.2文獻標(biāo)識碼：A文章編號：04
2、39-8114（2013）21-5282-03ApplicationofImmobilizationTechniqueinProducingChitosanaseYUANJian-ping，HOUXiao-qiang（CollegeofLifeScience，LangfangNormalUniversity，Langfang065000，Hebei，China）Abstract：Chitosanaseproductionwasoptimizedthroughevaluatingthreemethodsofcellsimmobilizationusingtheactivit
3、yandstabilityof9enzymeproductionasindicators.Fourmethodsofenzymeimmobilizationwereevaluatedusingoftheenzymecombinationefficiency，enzymeactivityrecoveryandenzymestabilityasindicators.Theresultsshowedthatthesodiumalginateandchitosanembedmethodwastheoptimalmethodofcellsandenzymeimmobilizatio
4、nduetoitsbestperformanceintheactivityandstabilityofenzymeproductionandintheenzymeactivity，enzymecombinationefficiency，enzymeactivityrecoveryandenzymestability.Keywords：immobilizationtechnique；chitosan；chitosanase（EC3.2.1.99）；sodiumalginate殼聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.99）是一種高效、專一水解殼聚糖制備殼寡糖的酶[1
5、，2]。近年來，利用專一性殼聚糖酶水解殼聚糖制取殼寡糖已成為甲殼素工業(yè)的研究熱點與前沿[3，4]。目前殼聚糖酶研究多集中于菌種篩選與游離細胞產(chǎn)酶條件等方面。固定化細胞與固定化酶技術(shù)對于提高酶的生產(chǎn)與應(yīng)用效率有重要意義[5，6]。本試驗采用多種方法對產(chǎn)殼聚糖酶菌種及殼聚糖酶固定化進行研究，旨在篩選最適固定化細胞及固定化酶的方法。1材料與方法91.1藥品與試劑殼聚糖（脫乙酰度≥80%，濟南海得貝海洋生物工程公司），海藻酸鈉（黏度范圍：1.05～1.15，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心），乙酸、NaOH、甲醇、戊二醛、HCl、NaCl、CaCl2等試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2菌種與培
6、養(yǎng)基產(chǎn)殼聚糖酶菌株Yg，廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室保存提供。改良PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖30g，蛋白胨2g，KH2PO40.5g，（NH4）2SO40.5g，維生素B110mg，蒸餾水1000mL，115℃高壓滅菌30min[7]。產(chǎn)酶培養(yǎng)基：KCl5g，NaCl5g，MgSO4·7H2O5g，K2HPO40.75g，F(xiàn)eSO40.01g，蛋白胨8.5g，牛肉膏0.25g，殼聚糖10g，蒸餾水1000mL，pH7.5～8.0，121℃高壓滅菌30min[8]。1.3方法1.3.1固定化細胞產(chǎn)殼聚糖酶將Yg菌株于改良PDA斜面上活化2次，而后接
7、種于改良PDA液體培養(yǎng)基，36℃、180r/min培養(yǎng)16h，再用0.75%無菌生理鹽水5000r/min離心洗滌2次，每次20min，取菌體沉淀4℃保藏備用。采用3種方法對細胞進行固定化處理：①海藻酸鈉包埋法。取2.5%海藻酸鈉溶液50mL，加入2g濕菌體，攪拌混勻，用8號針頭從離液面10cm高處將其滴入2%9CaCl2溶液中，濾出凝膠小球，重新置于2%CaCl2溶液中，4℃靜置硬化2h[9]。②海藻酸鈉殼聚糖包埋法。2.5%海藻酸鈉溶液中加入1%的殼聚糖，配制海藻酸鈉殼聚糖膠體溶液。取該溶液50mL，加入2g濕菌體，攪拌混
