新支流法規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)

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1、雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感（H9亞型）、傳染性法氏囊病四聯(lián)滅活疫苗（LaSota株+M41株+YBF003株+S-VP2蛋白）制造及檢驗試行規(guī)程(草案)本品系用雞新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株、H9亞型禽流感病毒YBF003株分別接種易感雞胚培養(yǎng)、收獲感染胚液、超濾濃縮后經(jīng)甲醛溶液滅活；雞傳染性法氏囊病毒系用表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大腸桿菌基因工程菌E.coliBL21/pET28a-VP2（簡稱S-VP2蛋白）經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、菌體破碎、離心去除菌體碎片、提純、滅活殘留細(xì)菌

2、；將四種抗原按適當(dāng)比例混合后加入優(yōu)質(zhì)油佐劑，混合乳化制成。用于預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感和傳染性法氏囊病。1毒種1.1毒種來源制造本品用的雞新城疫病毒LaSota株、效檢用雞新城疫強(qiáng)毒北京株(CVCCAV1611株）、雞傳染性支氣管炎病毒M41株、傳染性法氏囊病病毒BC6-85株（CVCCAV7株）均購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，由青島易邦生物工程有限公司鑒定、保管和供應(yīng)；雞傳染性法氏囊病生產(chǎn)用菌種為表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大腸桿菌基因工程菌，菌株名稱為E.coliBL21/pET28a-VP2（

3、簡稱S-VP2蛋白）、A型禽流感病毒（H9亞型）A/Chicken/shandong/11/05（H9N2）株（簡稱YBF003株），由青島易邦生物工程有限公司鑒定、保存和供應(yīng)。1.2毒（菌）種標(biāo)準(zhǔn)1.2.1雞新城疫病毒LaSota株應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)1.2.1.1對雞腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）應(yīng)為0.1～0.4。1.2.1.2對雞胚最小致死量的平均死亡時間（MDT/MLD）應(yīng)為103～119小時。1.2.1.3對雞胚的毒力將毒種用滅菌生理鹽水作100倍稀釋，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10個，每胚0.1ml，置36～37℃繼續(xù)孵

4、育，雞胚應(yīng)于接種后24～120小時死亡7個，胎兒須有明顯充血、出血病痕。1.2.1.4紅細(xì)胞凝集價按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行測定，含毒雞胚液對雞紅細(xì)胞凝集價應(yīng)不低于1:512（微量法）。1.2.1.5病毒含量將含毒雞胚液用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-7、10-8、10-93個稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5個，每胚0.1ml，置36～37℃33繼續(xù)孵育，48小時內(nèi)死亡的雞胚棄去不計，在48～120小時內(nèi)死亡的雞胚隨時取出，收獲雞胚液，同一稀釋度的胚液等量混合，按稀釋度分別測定紅細(xì)胞凝集價，至120小時，取出所

5、有活胚，逐個收取雞胚液，分別測定紅細(xì)胞凝集價，凝集價不低于1:128（微量法）者判為感染，計算EID50，每0.1ml病毒含量應(yīng)≥108.0EID50。1.2.1.6安全性用2～7日齡SPF雛雞20只，分為兩組，第1組10只，每只滴鼻接種5倍稀釋的含毒胚液0.05ml；第2組10只，不接種作為對照。兩組在同條件下分別飼養(yǎng)管理，觀察10日，應(yīng)無不正常反應(yīng)。如有非特異性死亡，免疫組和對照組均應(yīng)不超過1只。1.2.1.7免疫原性對30日齡SPF雛雞滴鼻免疫，最小免疫劑量應(yīng)≤5000EID50。1.2.1.8特異性將毒種用滅菌生理鹽水

6、作1000倍稀釋（約含105.0EID50/0.1ml），與等量抗新城疫病毒特異性血清混合，置室溫中和1小時后，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚10個，每胚0.2ml；同時設(shè)病毒對照10個，尿囊腔內(nèi)接種1000倍稀釋的病毒液，每胚0.1ml，觀察120小時。在24～120小時內(nèi)中和組雞胚應(yīng)不引起特異性死亡且至少存活8個，雞胚液作紅細(xì)胞凝集試驗，應(yīng)為陰性；對照組雞胚應(yīng)至少死亡7個，且雞胚液作紅細(xì)胞凝集試驗應(yīng)為陽性。1.2.1.9純凈按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。1.2.1.10基礎(chǔ)種子代數(shù)E4

7、-1～E4-10代。1.2.1.11毒種保存在-70℃以下保存，有效期為72個月。1.2.2雞新城疫病毒北京株(CVCCAV1611株）應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)1.2.2.1對雞最小致死量用2～8月齡SPF雞4只，各肌肉注射10-7或10-8稀釋度的病毒液1ml，14日內(nèi)應(yīng)全部死于新城疫。1.2.2.2對雞胚半數(shù)致死量將毒種作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-83個稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5個，每胚0.1ml，記錄接種后24～72小時死亡且胎兒病痕明顯的雞胚，計算ELD50，每0.1ml病毒含量應(yīng)≥107.0E

8、LD50。1.2.2.3純凈性按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染。1.2.2.4毒種保存在-70℃以下保存，有效期為72個月。1.2.3傳染性支氣管炎病毒M41株應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)331.2.3.1對雞胚的毒力將毒種用滅菌生理鹽水作10倍稀釋，尿囊