酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)教學(xué)提綱.ppt

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1、酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)實驗?zāi)康尿炞C酶聯(lián)免疫吸附試驗的基本原理掌握雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法的基本原理掌握酶聯(lián)免疫試劑盒的基本組成熟悉酶聯(lián)免疫操作方法實驗內(nèi)容簡介酶聯(lián)免疫吸附試驗是最常用的酶聯(lián)免疫分析技術(shù)，有四種基本類型：夾心法（雙抗體夾心和雙抗原夾心）、間接法、競爭法、捕獲法。本實驗以雙抗體夾心法測定乙型肝炎表面抗原（HBsAg）為例，驗證酶聯(lián)免疫吸附試驗的基本原理。實驗原理雙抗體夾心法篩選兩種抗-HBsAg（針對不同抗原表位），一種連接于固相載體制備酶標(biāo)反應(yīng)板；另一種標(biāo)記過氧化物酶制備酶標(biāo)抗體。測定時，待測抗原分別與

2、固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體雙抗體夾心復(fù)合物。實驗材料ELISA試劑盒預(yù)包被抗體酶標(biāo)反應(yīng)板系列標(biāo)準(zhǔn)品抗原酶標(biāo)抗體（抗HBsAg-HRPO）質(zhì)控血清顯色底物終止液濃縮洗液實驗方法制備酶標(biāo)板包被封閉實驗準(zhǔn)備標(biāo)本編號所有試劑平衡至室溫稀釋洗液實驗方法操作步驟加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本，37℃溫浴30min；洗滌3~5次，加酶標(biāo)記抗體；37℃溫浴30min；洗滌3-5次，加顯色液A和顯色液B；室溫15min，再加入終止液;讀取A450nm繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線采用Logistic曲線擬合劑量反應(yīng)曲線結(jié)果判斷準(zhǔn)

3、確使用微量加樣器所有試劑需平衡至室溫加入試劑或標(biāo)本后需輕輕振蕩洗滌過程要標(biāo)準(zhǔn)化注意事項實驗討論問題:HBsAg定量分析的臨床意義？酶聯(lián)免疫吸附試驗的注意事項？如何檢測抗-HBsAg？天津醫(yī)科大學(xué)李會強實驗二酶免疫組織化學(xué)染色技術(shù)（驗證性實驗）實驗?zāi)康尿炞C酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理掌握PAP-酶免組化法的檢測原理熟悉PAP-酶免組化技術(shù)操作要領(lǐng)實驗內(nèi)容簡介酶免疫組織化學(xué)技術(shù)集抗原抗體結(jié)合的特異性、酶免疫分析的敏感性和組織化學(xué)技術(shù)的直觀性特點為一體，常用于細(xì)胞鑒定、抗原定位、病理組織觀察等方面。本實驗以辣根過氧化

4、物-抗辣根過氧化物免疫組化技術(shù)檢測成熟CD3+T細(xì)胞為例，對這一技術(shù)的原理和操作流程進(jìn)行驗證。實驗原理要點：特異性抗體識別抗原PAP復(fù)合物的放大效應(yīng)橋聯(lián)抗體連接作用實驗材料一抗（識別抗體）：抗CD3抗體PAP復(fù)合物：過氧化物酶抗-過氧化物酶二抗（橋聯(lián)抗體）：兔抗鼠Ig實驗方法分離外周血單個核細(xì)胞采用密度梯度離心法分離制片免疫反應(yīng)加一抗，37℃60min洗滌玻片3次同時加橋聯(lián)抗體和PAP復(fù)合物，37℃30min洗滌玻片3次加底物顯色鏡檢注意事項制片時，細(xì)胞均勻，密度適中免疫反應(yīng)過程中，洗滌充分濕盒中反應(yīng)，防止

5、干片鏡檢時，注意區(qū)分特異和非特異結(jié)果分析采用高倍鏡觀察計數(shù)。將待檢載破片置普通光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈棕黃色，計數(shù)200個細(xì)胞，計算CD3+細(xì)胞的百分比。實驗討論思考題：酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的影響因素有哪些？在酶免疫組織化學(xué)技術(shù)中，為何不直接將酶蛋白標(biāo)記在抗體分子上？酶免疫組織化學(xué)技術(shù)有何優(yōu)點？天津醫(yī)科大學(xué)李會強實驗三酶聯(lián)免疫試劑盒的研制（設(shè)計性實驗）實驗?zāi)康氖煜っ嘎?lián)免疫試劑盒研制要點抗原純化與抗體制備制備酶標(biāo)記抗原（或抗體）方法選擇與設(shè)計篩選抗體（抗體匹配）優(yōu)化反應(yīng)條件實驗相關(guān)知識簡介理論知識酶聯(lián)免疫吸

6、附試驗相關(guān)技術(shù)蛋白純化酶標(biāo)記化合物制備酶標(biāo)反應(yīng)板制備實驗要求題目：假設(shè)需采用酶聯(lián)免疫法測定某種腫瘤標(biāo)志物，設(shè)計實驗如何制備酶聯(lián)免疫試劑盒？要求：設(shè)計實驗方案，繪制技術(shù)路線圖說明重要實驗內(nèi)容和實驗方法實施策略重要環(huán)節(jié)：純化抗原和制備抗體方法學(xué)選擇與設(shè)計抗原抗體選擇抗體匹配（雙抗體夾心法）確定工作濃度優(yōu)化反應(yīng)條件總結(jié)與討論問題：研制酶聯(lián)免疫試劑盒需做哪些準(zhǔn)備工作？如何根據(jù)待測物質(zhì)特性選擇合適反應(yīng)類型？雙抗體夾心法如何進(jìn)行抗體匹配實驗？理想劑量反應(yīng)曲線應(yīng)具備哪些條件？天津醫(yī)科大學(xué)李會強實驗四定量酶免疫分析中標(biāo)準(zhǔn)曲

7、線的數(shù)學(xué)模型（設(shè)計性實驗）實驗?zāi)康恼莆粘Ｓ脴?biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)學(xué)模型線性回歸法logistic曲線擬合實驗相關(guān)知識簡介理論知識基本變量分析物濃度和信號強度免疫分析的特殊性待測物濃度影響反應(yīng)速率曲線擬合方式影響測定結(jié)果實驗要求題目：根據(jù)所給數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或得出數(shù)學(xué)模型。CEA濃度（ng/ml）0102050100200400A值0.0540.3300.4560.7791.2311.7262.397實施策略兩種方式擬合四參數(shù)Logistic曲線擬合Logit-log直線回歸總結(jié)與討論問題：直線回歸有幾種常用方式？說明

8、各自特點。曲線擬合有幾種常用方式？說明各自特點。如何評價劑量反應(yīng)曲線擬合方式？天津醫(yī)科大學(xué)李會強此課件下載可自行編輯修改，僅供參考！感謝您的支持，我們努力做得更好！謝謝