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《 超分辨熒光顯微技術(shù)原理.docx》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、2014年的諾貝爾理綜獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給了“超分辨熒光顯微技術(shù)”。也許接下來(lái)的幾天，媒體會(huì)關(guān)注StefanHell、EricBetzig二人的傳奇經(jīng)歷，或者另一名華人女科學(xué)家與該獎(jiǎng)項(xiàng)失之交臂的遺憾。但是八卦之外，這項(xiàng)成果背后的科學(xué)本身也非常有意思。
這里面有三個(gè)關(guān)鍵詞：“超分辨”、“熒光”和“顯微技術(shù)”，我希望能夠解釋清楚以下幾個(gè)問(wèn)題，尤其是后兩個(gè)問(wèn)題：
1.為什么需要（光學(xué)）顯微技術(shù)？
2.為什么光學(xué)顯微鏡的分辨率存在理論極限？
3.用怎樣的方法可以突破這個(gè)理論極限以達(dá)到“超分辨”為什么這個(gè)理論極限可以被突破？
5.為什么非得是熒光顯微技術(shù)，而非普通的明場(chǎng)
2、（透射光）顯微技術(shù)？
1.采樣定理與顯微鏡
我們用肉眼觀察或者用相機(jī)拍攝一個(gè)物體時(shí)，物體上的每一個(gè)細(xì)微的點(diǎn)都會(huì)在眼睛的視網(wǎng)膜或是相機(jī)的感光芯片上成像。那么我們?yōu)槭裁床荒芸吹郊?xì)菌等微小的東西，為什么不能把照片無(wú)限放大以看清遠(yuǎn)處樹(shù)木上面的每一片葉子呢？
這個(gè)問(wèn)題的答案比較簡(jiǎn)單：因?yàn)榻M成視網(wǎng)膜的每一個(gè)感光細(xì)胞（視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞）、相機(jī)芯片上的每一個(gè)感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。比如視網(wǎng)膜中央凹區(qū)域的視錐細(xì)胞直徑平均約為5微米。而由于奈奎斯特-香農(nóng)采樣定理的限制，視網(wǎng)膜上能分清的兩個(gè)相鄰像點(diǎn)的距離是視錐細(xì)胞直徑的兩倍，即10微米。再結(jié)合眼
3、球的構(gòu)造，大致可以推斷出，在距離眼睛25厘米的位置，我們能分辨物體上相距為80微米的兩個(gè)點(diǎn)，換算成點(diǎn)陣密度就是大約320ppi，這也是蘋(píng)果所謂“視網(wǎng)膜屏”分辨率的來(lái)歷。
如果要觀察小于80微米的物體，比如細(xì)菌，就需要先將物體放大，再用眼睛或者相機(jī)觀察?，F(xiàn)代光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造其實(shí)非常簡(jiǎn)單，樣品放置在物鏡的焦點(diǎn)處，從樣品上發(fā)射或散射的光經(jīng)過(guò)物鏡變成平行（準(zhǔn)直）光，再經(jīng)過(guò)一個(gè)結(jié)像透鏡，然后會(huì)聚到相機(jī)的感光芯片上成像。
按照前面的方法來(lái)推算，要區(qū)分物體上相距為200納米的兩個(gè)點(diǎn)，如果使用科研級(jí)相機(jī)，比如最近火起來(lái)的sCMOS相機(jī)（每個(gè)感光像素尺寸為微米），只
4、需要使用放大倍率為65倍的物鏡就足夠了。
那么是否可以通過(guò)提高物鏡的放大倍率來(lái)觀察低于200納米的物體，比如細(xì)胞里面微管呢？
答案是不可以。
2.光學(xué)衍射極限
由于光是一種電磁波，具有衍射和干涉的特性。
圖1.光學(xué)顯微鏡簡(jiǎn)化示意圖
如上面的簡(jiǎn)圖所示，紫色箭頭表示的物體PQ經(jīng)過(guò)物鏡等之后在相機(jī)上成像為P'Q'。由于光的衍射，物體上的點(diǎn)如P、Q，在相機(jī)上并不是單獨(dú)的點(diǎn)，而是一個(gè)個(gè)有一定大小的斑，被稱(chēng)為夫瑯禾費(fèi)衍射斑（或稱(chēng)艾里斑），如右側(cè)的同心圓所示。那么，當(dāng)P'、Q'相距太近的時(shí)候，兩個(gè)斑會(huì)疊加導(dǎo)致難以分辨。這就要求物體上的P、Q要相距一定的距離
5、。
1873年，德國(guó)物理學(xué)家、卡爾蔡司公司的恩斯特·阿貝（ErnstAbbe）首次推算出衍射導(dǎo)致的分辨率極限。根據(jù)瑞利判據(jù)——“當(dāng)一個(gè)像斑的中心落到另一個(gè)像斑的邊緣時(shí)，就算這兩個(gè)像剛好能被分辨”，顯微鏡能分辨的物體上兩點(diǎn)P、Q的最小距離h為：
這個(gè)公式就是光學(xué)顯微鏡的分辨率公式，或稱(chēng)為光學(xué)衍射極限。（注意此處的分辨率與通常說(shuō)的顯示器分辨率含義不同）
其中，為光的波長(zhǎng)，n為物方的折射率，為物體與物鏡邊緣連線和光軸的夾角。如上圖所示。為方便起見(jiàn)，其中的通常稱(chēng)為數(shù)值孔徑，簡(jiǎn)寫(xiě)為NA。
攝影領(lǐng)域常用f/#或稱(chēng)光圈值來(lái)描述鏡頭，光圈值與數(shù)值孔徑可以相
6、互換算。對(duì)于一枚光圈為的鏡頭來(lái)說(shuō)，數(shù)值孔徑為，其分辨能力約微米。
目前常用的高倍物鏡NA最大為，可以算出，對(duì)于可見(jiàn)光，比如波長(zhǎng)500納米的綠光，顯微鏡的分辨率約為200納米。所以，即使再提高物鏡的放大倍率，也不能提高顯微鏡的分辨率。
而200納米這個(gè)數(shù)值也就通常被稱(chēng)作衍射極限。
.光學(xué)衍射極限的動(dòng)態(tài)范圍
從上面的公式可以看到，光學(xué)衍射極限其實(shí)并不是一個(gè)具體的數(shù)值，如果改變上述公式中的參數(shù)，是可以有效提高分辨率的。
(1)光的波長(zhǎng)
可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍是400~760nm，如果使用更短波長(zhǎng)的光，比如紫外線，理論上可以提高分辨率。但是紫外線能量高，易損傷
7、樣品，而且透射能力低，很難透過(guò)物鏡。人們想到了使用高能電子束代替光束，比如200keV的電子對(duì)應(yīng)的的布羅意波長(zhǎng)為納米（*米）。雖然NA相對(duì)較?。s為10°），依然可以達(dá)到納米的理論分辨率。這就是電子顯微鏡的基本原理。
嚴(yán)格的說(shuō)，電鏡的分辨率依然限制在光學(xué)衍射極限的范圍內(nèi)。只不過(guò)這里的“光學(xué)”是“電子光學(xué)”。
(2)物方折射率n
空氣折射率為1，水的折射率，玻璃折射率。目前主要的物鏡都是玻璃材質(zhì)，并在物鏡與樣品之間用與玻璃折射率一致的油來(lái)浸潤(rùn)，以提高分辨率。
2012年Olympus發(fā)布了一款NA高達(dá)的物鏡，光學(xué)部分使用藍(lán)寶石（折射率約）制作，并搭
8、配高折射率的鏡油（目測(cè)成分應(yīng)該是二碘甲烷Methyleneiodide）。
也許在未來(lái)能發(fā)明
