牛蒡苷元的制備及其抗腫瘤作用機(jī)制.docx

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1、牛蒡苷元的制備及其抗腫瘤作用機(jī)制惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的的主要疾病之一,全球平均每8個(gè)死亡病例中就有1人死于癌癥。目前,大多數(shù)的抗腫瘤藥物雖然具有一定療效,但仍然存在著副作用大、價(jià)格昂貴等諸多劣勢(shì)。因此,尋找新型、高效、低毒的抗腫瘤藥物是我們面臨的巨大挑戰(zhàn)。我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在治療腫瘤方面有著悠久的歷史,中草藥中含有多種具有很強(qiáng)抗腫瘤作用的植物單體,如何將其分離提取出來(lái)并進(jìn)行合理的開(kāi)發(fā)利用,成為了世界醫(yī)學(xué)面臨的重要課題?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明,中藥牛蒡子具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性。其主要有效成分牛蒡苷(Arctiin,ARC)在人體內(nèi)生物利用度低,需經(jīng)腸道微生物酶解轉(zhuǎn)化

2、為牛蒡苷元(Arctigenin,ARG)方能吸收入血液,發(fā)揮藥效。目前,藥學(xué)研究用ARG多為實(shí)驗(yàn)室自制,其制備方法都或多或少存在著一些不足之處,如提取效率低、步驟繁雜、對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求高等。本研究采用微生物發(fā)酵法和硅膠柱層析法從牛蒡子粉中分離純化ARG,成功建立了一種簡(jiǎn)便高效的提取方法。此外,據(jù)相關(guān)報(bào)道,ARG可以抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),但對(duì)于其抗腫瘤作用的分子機(jī)制卻知之甚少。本研究選取人肝細(xì)胞癌作為研究對(duì)象,對(duì)ARG體內(nèi)外抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了深入探討。ARG的制備:本研究采用微生物發(fā)酵法,篩選出泡盛曲霉變種和里氏木霉作為發(fā)酵菌種,利用兩株霉菌所產(chǎn)生的生物酶對(duì)牛蒡子粉進(jìn)行炮制

3、,將牛蒡子粉中的牛蒡苷轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元。并且通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間、pH、裝液量、接種量、發(fā)酵底物固液比、碳氮比等諸多因素進(jìn)行優(yōu)化,制定出一套牛蒡子粉最佳發(fā)酵工藝,可使牛蒡苷轉(zhuǎn)化率達(dá)97.8%,產(chǎn)物溶出率達(dá)95.7%,損失率低至4.3%。最后采用硅膠柱層析法純化牛蒡子發(fā)酵粗提物,牛蒡苷元純化產(chǎn)物為白色晶體,純度可達(dá)到99%以上。ARG體外抗腫瘤機(jī)制研究:通過(guò)MTT比色法檢測(cè)ARG在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞株的增殖抑制活性,結(jié)果表明ARG具有良好的廣譜抗癌活性,但對(duì)正常細(xì)胞卻沒(méi)有明顯的抑制作用。為進(jìn)一步研究ARG的抗腫瘤機(jī)制,本研究選擇人肝細(xì)胞癌作為研究對(duì)象,通過(guò)A

4、nnexinV-FITC/PI雙染法、透射電鏡觀察、線(xiàn)粒體跨膜電位檢測(cè)、和Hoechst33342/免疫熒光染色等試驗(yàn)方法從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)角度說(shuō)明ARG可以誘導(dǎo)HepG2和SMMC7721細(xì)胞的凋亡。而后,采用qPCR、流式細(xì)胞儀和Westernblot等試驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路及凋亡相關(guān)因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)ARG作用于HepG2細(xì)胞時(shí),首先會(huì)破壞細(xì)胞線(xiàn)粒體的氧化還原功能,同時(shí)使NADPH酶和細(xì)胞色素P450酶參與的代謝過(guò)程發(fā)生異常,從而導(dǎo)致細(xì)胞中ROS水平升高。在ROS的影響下,MAPK信號(hào)通路中JNK和p38被激活,兩者共同促進(jìn)了HepG2細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑的活化

5、,于此同時(shí),p38參與激活其外源性凋亡途徑并上調(diào)p53的表達(dá)。最終,在兩條凋亡途徑共同作用下,細(xì)胞中的caspase蛋白群被激活,從而介導(dǎo)了HepG2凋亡的發(fā)生。此外,ARG還可以抑制HepG2細(xì)胞中NF-κB的核轉(zhuǎn)移和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活。上述結(jié)果表明ARG是一種“多靶點(diǎn)”化合物,它可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。ARG體內(nèi)抗腫瘤機(jī)制研究:在對(duì)裸鼠人肝癌移植瘤進(jìn)行體內(nèi)抑癌作用研究中發(fā)現(xiàn),ARG對(duì)人肝癌移植瘤具有顯著的抑制作用,20mg/kgARG對(duì)HepG2移植瘤抑瘤率可達(dá)44.55%。并且?guī)缀醪粫?huì)對(duì)荷瘤小鼠的一般狀態(tài)及肝、肺、腎等主要臟器產(chǎn)生不良

6、影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),ARG在體內(nèi)抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。其主要作用機(jī)制是通過(guò)上調(diào)p-JNK、p-p38、Bax以及TNF-α的表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。ARG體內(nèi)抗腫瘤研究說(shuō)明ARG不僅可以抑制腫瘤的生長(zhǎng),同時(shí)具有低毒的作用特點(diǎn),此研究結(jié)果為ARG的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。綜上所述,本研究發(fā)明建立了一種簡(jiǎn)便高效的ARG提取方法,適合于實(shí)驗(yàn)室自行提取制備ARG,并且此方法具有成本低廉、提取純度高、污染少等諸多優(yōu)點(diǎn)。在此基礎(chǔ)之上,本研究對(duì)ARG的抗腫瘤作用及其體內(nèi)外作用機(jī)制進(jìn)行了深入探索。研究結(jié)果表明,ARG在體內(nèi)外均具有良好的抗腫瘤作用,其作用機(jī)制主要

7、是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。與此同時(shí),研究還發(fā)現(xiàn)ARG在體外幾乎不會(huì)對(duì)正常組織細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用,且在動(dòng)物體內(nèi)具有低毒的作用特點(diǎn)。由此可見(jiàn),ARG是一種極具開(kāi)發(fā)潛力的抗腫瘤化合物,本項(xiàng)研究為ARG的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。