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1、豬圓環(huán)病毒研究概況蘆銀華陳溥言南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院1、豬圓環(huán)病毒（porcinecircovirus，PCV）概況2、PCV復(fù)合PCR方法的建立及初步應(yīng)用3、PCV2毒株的分離及鑒定4、PCV2全基因組的克隆及序列分析5、PCV2分子克隆化病毒的構(gòu)建6、PCV2主要結(jié)構(gòu)蛋白基因（ORF2）的克隆與真核表達7、PCV2單克隆抗體的研制豬圓環(huán)病毒（porcinecircovirus，PCV）與雞貧血病毒（CAV）、鸚鵡喙羽病病毒（PBFDV）和一些植物病毒同屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）成員，為單股負鏈環(huán)狀DNA病毒，直徑15-17nm，為已
2、知最小的動物病毒之一。PCV與同病毒科的CAV和PBFDV沒有任何抗原交叉性及基因序列同源性。一、豬圓環(huán)病毒概況PCV基因組結(jié)構(gòu)PCV-1、2基本情況1、PCV-1基因組全長1，759bp，PCV-2為1，768bp；基因組核苷酸序列同源性僅為68%-75%。2、PCV-1、2都主要包含ORF1、ORF2兩個閱讀框；ORF1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白；ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白，具有良好的免疫原性。3、PCV-1無致病性，廣泛存在于豬源細胞及正常豬體內(nèi)各組織中；PCV-2現(xiàn)證明與斷奶仔豬多系統(tǒng)消耗綜合征（PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS）及
3、A2型先天性綜合征相關(guān)。PCV致病性及危害1、PCV可在豬源細胞培養(yǎng)物上繁殖，不產(chǎn)生CPE，易被忽視，因此對豬源細胞疫苗或診斷抗原生產(chǎn)造成潛在的危害。2、PCV-2多數(shù)情況下引起亞臨床感染，但如與其他病原如PPV等混合感染或環(huán)境應(yīng)激情況下則可直接發(fā)生PMWS。3、PCV-2的靶細胞為淋巴細胞，主要是B細胞，病毒感染后引起細胞凋亡，使機體免疫抵抗力下降，從而繼發(fā)感染其他病原體，包括PRRSV、豬鏈球菌等，引起更嚴重的疾病。研究目的1、建立一套完整的便于實際推廣應(yīng)用的檢測PCV感染的方法，如PCR、IFA及ELISA方法等。2、用建立的方法對我國主要養(yǎng)豬省
4、份進行PCV的流行病學(xué)調(diào)查，以便提出有效的綜合防治措施；二、復(fù)合PCR方法的建立1、引物設(shè)計引物1（為PCV-1、2共同序列）：5’-CCGCGGTGGCTGAACTT-3’（PCV-1nt478-496；PCV-2nt491-519）；引物2（PCV-1特異序列）：5’-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3’（PCV-1nt1108-1129）；引物3（PCV-2特異序列）：5’-ACCCCCGCCACCGTTACC-3’（PCV-2nt1627-1644）引物1、2擴增的片段長度為652bp，引物1、3之間的跨幅為1154bp。M123
5、MM：DNA分子量標準DL-20001：接種陽性PCV-1、2毒株的PK-15；2：接種陽性PCV-2毒株的PK-15；3：未接種病毒的PK-15。2000bp1000bp750bp500bp2、復(fù)合PCR方法的初步應(yīng)用1）對多株豬源傳代細胞（包括4株P(guān)K-15及1株ST細胞）進行了PCV檢測，發(fā)現(xiàn)所有細胞均污染有PCV-1，其中一株還擴增出了PCV-2基因片段；M：DNA分子量標準DL-20001：PK-15（a）2：PK-15（b）3：PK-15(c)4：PK-15(d)5：ST12345M2000bp1000bp750bp500bp2）對38個病
6、例（病豬表現(xiàn)為消瘦、呼吸困難及淋巴結(jié)腫大等）的組織（取肺）進行PCR擴增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，9個病例同時存在PCV兩種血清型病毒感染，23個病例感染有PCV-2。部分電泳結(jié)果見下圖。12345678M91011121314M圖中樣品1、3、4、6、12、14擴增出了PCV-2核酸片段；8、9及11含有兩種PCV的核酸；其余樣品為陰性。三、PCV-2毒株的分離鑒定病料處理（將PCR擴增陽性的組織病料用氯仿抽提去除有曩膜的病毒，如PRRSV）接種細胞—PK-15盲傳10代（300mmol/L的D-氨基葡萄糖處理）間接免疫熒光實驗及電鏡觀察病毒顆粒接種病料的PK-1
7、5的IIF結(jié)果未接種病料的PK-15的IIF結(jié)果超薄切片觀察結(jié)果（30，000×）本實驗室共分離鑒定了5株P(guān)CV-2，根據(jù)其分離地將其分別命名為ShanghaiPCV、JiangsuPCV、dengtaPCV、qingdaoPCV及xiaosanPCV。四、PCV2毒株全基因組克隆及序列分析1、DNAstar分析表明，PCV2全基因組1.768kb含有單一的EcoRI酶切位點。利用這一特點，上下游引物中都設(shè)計了EcoRI位點（-GAATTC-），以便于全基因組的體外操作。引物1：5’-GCGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTC-3’引物2
8、：5’-ATGAATTCTGGCCCTGCTCCC-3’2、PCR產(chǎn)物的克隆PCR電泳結(jié)果重組
