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1、SDSPAGE原理步驟詳細介紹含圖片一、什么是SDS十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate,SDS)是一種陰離子去污劑。它在水溶液中以單體（monomer）和分子團（micellae）的混合形式存在SDS的作用破壞蛋白質(zhì)分子之間以及其他物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變原有的構(gòu)象，保證蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合而形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物SDS和還原劑的作用： （1）分子被解聚或組成它們的多肽鍵 （2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負 電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束（3）蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負電荷
2、大大超 過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點 （1）形狀像一個長橢圓棒 （2）短軸對不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的 （3）長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比膠束在SDS-PAGE系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。 當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD—200KD之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系3、影響SDS電泳的關(guān)鍵因素 （1）溶液中SDS單體濃度 大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1：1.4（2）樣
3、品緩沖液的離子強度低離子強度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度（3）二硫鍵是否完全被還原 當二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關(guān)系。（二）緩沖系統(tǒng)的選擇 一般情況下，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白質(zhì)的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的電泳緩沖液的種類： 1、磷酸緩沖液 2、Tris-醋酸鈉緩沖系統(tǒng) 3、咪唑緩沖液系統(tǒng)： 比磷酸緩沖系統(tǒng)的導(dǎo)電性低，電泳速 度要比后者快一倍 4、尿素系統(tǒng)： 適用分子量
4、低于15KD的蛋白樣品 5、Tris-甘氨酸系統(tǒng)： 使用最多的緩沖液 6、Tris-硼酸鹽緩沖液： 測定糖蛋白的分子量（三）凝膠濃度的選擇由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇會直接影響分辨率。 不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度（四）分子量測定 1、相對遷移率（Rf） Rf即用每個帶的遷移距離除以溴酚藍前沿的遷移距離得到的。 測量位置應(yīng)在蛋白帶的中央。 蛋白帶遷移距離Rf=————————溴酚藍遷移距離蛋白帶遷移距離固定前的凝膠長度Rf=——————
5、———X—————————干燥后的凝膠長度溴酚藍遷移距離2、作圖 以已知蛋白質(zhì)分子量的常用對數(shù)值為縱坐標，Rf為橫坐標繪圖3、通過測定未知蛋白質(zhì)的Rf值，便可在標 準曲線上讀出他的分子量二、去污劑的選擇 無離子去污劑：LubroW；Brij35，Tween Triton陽離子去污劑：cetyltrimethylammonium bromide（CTAB） cetylpyyridinium（CPC）陰離子去污劑：SDSdeoxycholate三、方法 1、分類 （1）根據(jù)對樣品的處理方式的不同 還原SDS電泳 非還原SDS電泳 帶
6、有烷基化作用的還原SDS電泳（2）根據(jù)緩沖系統(tǒng)和凝膠孔徑的不同 連續(xù)電泳 不連續(xù)電泳 （3）根據(jù)電泳的形式 圓盤電泳 垂直電泳 平板電泳 水平電泳2、操作 （1）制備分離膠 （2）制備積層膠(堆積膠）分離膠聚合之后（3）加樣品樣品的處理 在蛋白溶液中加入過量的SDS后，可引起以下的反應(yīng)： 蛋白質(zhì)本身的電荷被屏蔽氫鍵斷裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折疊(二級結(jié)構(gòu)破壞),并形成橢球型①還原SDS處理當加入還原試劑DTT或β-二巰基乙醇后，蛋白質(zhì)被完全去折疊，只根據(jù)分子量分離②帶有烷基化作用的還原SDS處理烷基化作用可以很好地并
7、經(jīng)久牢固地保護SH基團，而得到窄的電泳帶③非還原的SDS處理許多樣品，如生理體液、血清或尿素，一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分鐘，并不需要加還原劑，此時二硫鍵不能被斷裂，蛋白并沒有完全被去折疊（4）電泳（5）固定（6）染色 考馬斯亮藍（coomassiebrilliantblue） ①R-250三苯基甲烷，紅藍色，每個分子含有兩個SO3H基團，偏酸性，和氨基黑一樣也是結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團上②G-250二甲花青亮藍，藍綠色。銀染色 銀染的機制是將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上（7）照相，凝膠
8、干燥（8）定量測定3、電泳過程中的不正?，F(xiàn)象 （1）“微笑”現(xiàn)象指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好（2）“皺眉”現(xiàn)象由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠
