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《cDNA和基因組文庫(kù)DNA的構(gòu)建.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、第九章cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)構(gòu)建基因組文庫(kù)是含有某種生物體全部基因的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體；cDNA文庫(kù)是指含有所有重組cDNA的克隆群體。 ? 基因組文庫(kù)：來(lái)源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構(gòu)建，基因組序列分析，基因在染色體上的定位，基因組中基因的結(jié)構(gòu)和組織形式等。cDNA文庫(kù)：來(lái)源于細(xì)胞表達(dá)出的RNA，反映基因組表達(dá)的基因序列信息，用于研究特定細(xì)胞中基因的表達(dá)狀態(tài)和表達(dá)基因的功能等。? 基因文庫(kù)＝基因組文庫(kù)＋cDNA文庫(kù)一、載體的種類(lèi)和特征：受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片
2、段舉例質(zhì)粒E.coli環(huán)狀很小，<8kbpUC18/19,T-載體, pGEM3zλ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀<10kbM13系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbBACE.coli環(huán)狀約300kbPACE.coli環(huán)狀100-800kbPCYPACYAC酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC哺乳動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀>1000kb病毒載體動(dòng)物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲(chóng)桿狀病毒載體穿梭載體動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒，二
3、、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建分為六個(gè)階段： 階段1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈 階段2：cDNA第二鏈的合成 階段3：cDNA的甲基化 階段4：接頭或銜接子的連接 階段5：Sepharose?CL-4B凝膠過(guò)濾法分離cDNA階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接cDNA文庫(kù)的構(gòu)建mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補(bǔ)DNA）第二條DNA鏈1：反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA第一鏈1.1.在置于冰上的無(wú)菌微量離心管內(nèi)混合下列試劑進(jìn)行cDNA第一鏈的合成：poly(A)?RNA?(1μg/μl)?10μl寡核苷酸引物(1μg/μl)
4、?1μl 1mol/L?Tris-HCl?(pH8.0,?37℃)?2.5μl 1mol/L?KCl?3.5μl 250?mmol/L?MgCl2?2μl dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L）10μl 0.1?mol/L?DTT?2μl RNase抑制劑（選用）25單位 加H2O至48μl 1.2.當(dāng)所有反應(yīng)組在0℃混合后，取出2.5μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)0.5ml微量離心管內(nèi)。在這個(gè)小規(guī)模反應(yīng)管中加入0.1μl?[α-32P]?dCTP（400?Ci/mmol,?10mCi/ml）。1.
5、3.大規(guī)模和小規(guī)模反應(yīng)管都在37℃溫育1h。1.4.溫育接近結(jié)束時(shí)，在含有同位素的小規(guī)模反應(yīng)管中加入1μl?0.25mol/L?EDTA，然后將反應(yīng)管轉(zhuǎn)移到冰上。大規(guī)模反應(yīng)管則在70℃溫育10?min，然后轉(zhuǎn)移至冰上。1.5.測(cè)定0.5μl小規(guī)模反應(yīng)物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質(zhì)量參照物通過(guò)堿性瓊脂糖凝膠電泳對(duì)小規(guī)模反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分析是值得的。1.6.按下述方法計(jì)算cDNA第一鏈的合成量[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA
6、第一鏈(μg) 1.7.盡可能快地進(jìn)行cDNA合成的下一步驟。2：cDNA第二鏈的合成2.1：cDNA第二鏈的合成將下列試劑直接加入大規(guī)模第一鏈反應(yīng)混合物中、10mMol/Lmgcl270ul2mM/LTris-Hcl(PH7.4)5ul 10?mCi/ml[α-32P]?dCTP（400?Ci/mmol）10μl 1?mol/L?(NH4)2SO41.5μl RNase?H?(1000單位/ml)?1μl大腸桿菌DNA聚合酶I?(10?000單位/ml)?4.5μl溫和振蕩將上述試劑混合，在微量離心機(jī)
7、稍離心，以除去所有氣泡。在16℃溫育2~4h。2.2.溫育結(jié)束，將下列試劑加到反應(yīng)混合物中：β-NAD?(50?mmol/L)?1μl大腸桿菌DNA連接酶(1000~4000單位/ml)?1μl室溫溫育15min。2.3.溫育結(jié)束，加入1μl含有4種dNTP的混合物和2μl?T4噬菌體DNA聚合酶。反應(yīng)混合物室溫溫育15分鐘。2.4.取出3μl反應(yīng)物，按步驟7和8描述的方法測(cè)定第二鏈DNA的質(zhì)量。2.5.將5μl?0.5?mol/L?EDTA?(pH8.0)加入剩余的反應(yīng)物中，用酚：氯仿和氯仿分別抽提混
8、合物一次。在0.3?mol/L(pH5.2)乙酸鈉存在下，通過(guò)乙醇沉淀回收DNA，將DNA溶解在90μl?TE(pH7.6)溶液中。2.6.將下列試劑加到DNA溶液中：10×T4多核苷酸激酶緩沖液10μl T4多核苷酸激酶（3000單位/ml）1μl室溫溫育15分鐘。2.7.測(cè)定從上面步驟4取出的3μl反應(yīng)物中放射性活度，測(cè)定1μl第二鏈合成產(chǎn)物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。2.8.用下面公式計(jì)算第二鏈反應(yīng)中所合成的cDNA量。要考慮到已
