高通量測(cè)序：第二代測(cè)序技術(shù)詳細(xì)介紹

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1、在過(guò)去幾年里，新一代DNA測(cè)序技術(shù)平臺(tái)在那些大型測(cè)序?qū)嶒?yàn)室中迅猛發(fā)展，各種新技術(shù)猶如雨后春筍般涌現(xiàn)。之所以將它們稱(chēng)之為新一代測(cè)序技術(shù)（next-generationsequencing），是相對(duì)于傳統(tǒng)Sanger測(cè)序而言的。Sanger測(cè)序法一直以來(lái)因可靠、準(zhǔn)確，可以產(chǎn)生長(zhǎng)的讀長(zhǎng)而被廣泛應(yīng)用，但是它的致命缺陷是相當(dāng)慢。十三年，一個(gè)人類(lèi)基因組，這顯然不是理想的速度，我們需要更高通量的測(cè)序平臺(tái)。此時(shí)，新一代測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它們利用大量并行處理的能力讀取多個(gè)短DNA片段，然后拼接成一幅完整的圖畫(huà)。Sanger測(cè)序大家都比較了解，是先將基因組DNA片斷化，然后克隆到質(zhì)粒載體上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對(duì)

2、于每個(gè)測(cè)序反應(yīng)，挑出單克隆，并純化質(zhì)粒DNA。每個(gè)循環(huán)測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生以ddNTP終止的，熒光標(biāo)記的產(chǎn)物梯度，在測(cè)序儀的96或384毛細(xì)管中進(jìn)行高分辨率的電泳分離。當(dāng)不同分子量的熒光標(biāo)記片斷通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，四通道發(fā)射光譜就構(gòu)成了測(cè)序軌跡。在新一代測(cè)序技術(shù)中，片斷化的基因組DNA兩側(cè)連上接頭，隨后運(yùn)用不同的步驟來(lái)產(chǎn)生幾百萬(wàn)個(gè)空間固定的PCR克隆陣列（polony）。每個(gè)克隆由單個(gè)文庫(kù)片段的多個(gè)拷貝組成。之后進(jìn)行引物雜交和酶延伸反應(yīng)。由于所有的克隆都是系在同一平面上，這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進(jìn)行。同樣地，每個(gè)延伸所摻入的熒光標(biāo)記的成像檢測(cè)也能同時(shí)進(jìn)行，來(lái)獲取測(cè)序數(shù)據(jù)。酶拷問(wèn)和成像的持續(xù)反復(fù)構(gòu)成了相鄰

3、的測(cè)序閱讀片段。Solexa高通量測(cè)序原理--采用大規(guī)模并行合成測(cè)序法(SBS,Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端終結(jié)技術(shù)（ReversibleTerminatorChemistry）--可減少因二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。--具有高精確度、高通量、高靈敏度和低成本等突出優(yōu)勢(shì)--可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測(cè)序和注釋?zhuān)┮约肮δ芑蚪M學(xué)（基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究----將接頭連接到片段上，經(jīng)PCR擴(kuò)增后制成Library。----隨后在含有接頭（單鏈引物）的芯片（flowcell）上將已加入接頭的DNA片段變成單鏈后通過(guò)與單鏈引物互補(bǔ)配

4、對(duì)綁定在芯片上，另一端和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)也被固定，形成“橋”----經(jīng)30倫擴(kuò)增反應(yīng)，形成單克隆DNA簇----邊合成邊測(cè)序（SequencingBySynthesis）的原理，加入改造過(guò)的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。這些dNTP是“可逆終止子”，其3’羥基末端帶有可化學(xué)切割的基團(tuán)，使得每個(gè)循環(huán)只能摻入單個(gè)堿基。此時(shí)，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類(lèi)。之后，將這些基團(tuán)化學(xué)切割，恢復(fù)3'端粘性，繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，就可以得知每個(gè)模板DNA片段的序列

5、。目前的配對(duì)末端讀長(zhǎng)可達(dá)到2×50bp，更長(zhǎng)的讀長(zhǎng)也能實(shí)現(xiàn)，但錯(cuò)誤率會(huì)增高。讀長(zhǎng)會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。Roche454測(cè)序技術(shù)“一個(gè)片段=一個(gè)磁珠=一條讀長(zhǎng)（Onefragment=Onebead=Oneread）”1）樣品輸入并片段化：GSFLX系統(tǒng)支持各種不同來(lái)源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300－800bp的片段；對(duì)于小分子的非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這一步則不需要。短的PCR產(chǎn)物則可以直接跳到步驟3)。2）文庫(kù)制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將

6、A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴(kuò)增和測(cè)序步驟。具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫(kù)。3）一個(gè)DNA片段＝一個(gè)磁珠：?jiǎn)捂淒NA文庫(kù)被固定在特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠上。每一個(gè)磁珠攜帶了一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫(kù)被擴(kuò)增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特片段的微反應(yīng)器。4）乳液PCR擴(kuò)增：每個(gè)獨(dú)特的片段在自己的微反應(yīng)器里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒(méi)有其他的競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。整個(gè)片段文庫(kù)的擴(kuò)增平行進(jìn)行。對(duì)于每一個(gè)片段而言，擴(kuò)增后產(chǎn)生了幾百萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴(kuò)增的片段仍然結(jié)合

7、在磁珠上。5）一個(gè)磁珠＝一條讀長(zhǎng)：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進(jìn)行后繼的測(cè)序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個(gè)磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GSFLX中，測(cè)序開(kāi)始。放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在ATP硫酸化酶和螢光素酶的作用下，經(jīng)過(guò)一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將螢光素氧