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《雙向熒光原位雜交手冊(cè)(2_dimension-fish_protocol)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、組織（細(xì)胞）間期核2-dimensionDNAFISH實(shí)驗(yàn)步驟Note：依照本protocol進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)兩大關(guān)鍵因素：一是樣品玻片的制備，包括細(xì)胞核釋放的多少，點(diǎn)片的細(xì)胞密度，玻片背景的干凈與否，溶液的新鮮程度，蛋白酶消化的時(shí)間等；二是BAC探針的制備純化，包括BAC的純度，探針的質(zhì)量，不同探針的比例，與樣品孵育的時(shí)間等；另外，溫度，濕度，光照也要嚴(yán)格按要求進(jìn)行。一、組織間期核制備過程1．組織放入平皿中，加含50ul雙抗的PBS5ml泡10min。2．用PBS洗一下，剪碎。3．加膠原酶5ul和培養(yǎng)液5ml放入37度過夜。（該步驟只針對(duì)不易釋放游離細(xì)胞的組織）——過夜消化則以
2、上操作均需在超凈臺(tái)進(jìn)行，以防污染（細(xì)胞：PBS洗兩遍，消化細(xì)胞，收集，PBS洗一遍，細(xì)胞數(shù)太少則不洗）。4.將組織碎塊（細(xì)胞）在15ml離心管中加0.075MKCL10ml，37℃水浴鍋內(nèi)低滲30min。5.取出加固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）2-3滴混勻，室溫1000rpm離心10min棄上清。6.加固定液10ml混勻后，室溫靜置30min，離心棄上清。7.步驟6重復(fù)三次后加入固定液1.5ml，混勻后靜置1~2min，將上層較為清亮的細(xì)胞懸液約1ml轉(zhuǎn)于1.5mlEP管內(nèi)4℃存放。（長期可置-20℃凍存）8.點(diǎn)片：將適當(dāng)細(xì)胞密度的懸液0.2-1μl點(diǎn)于玻片上，用鉆石筆在玻
3、片背面劃出范圍，室溫過夜。二、熒光探針的標(biāo)記（隨機(jī)引物）1.預(yù)變性(PCR儀)templateDNA(dsDNA)200ng2.5xKenelowbuffer(invitrogen)10μlddH2O---------------------------------------------------Σ12.5μl95℃10min2.取出PCR管,立即放冰上1~2min3.室溫加缺T的dNTP(A/C/G:T=0.5:0.25),各管加4μl4.快速各加8μl所要標(biāo)記的熒光素(eg.Cy3-dUTP)，馬上避光5.再各加0.5μlKenelow酶，混勻后輕微離心一下（甩一下
4、即可），37℃避光過夜（16小時(shí)以上），此時(shí)PCR管內(nèi)溶液的總體積為25μl。6.第二天加2.5μlstopbuffer混勻，瞬時(shí)離心后4℃避光存放。三、Fluorescenceinsituhybridization(直接標(biāo)記)注意：73℃水浴鍋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前開始調(diào)溫度開關(guān)鍵，立式染缸應(yīng)在40℃前放入水浴鍋，否則易使染缸破裂。（一）、前期處理玻片的處理1.10μg/μlRNase1.0μl現(xiàn)配1：100溶于2XSSC99μl,37℃消化40min(將2XSSC加到PCR管中再將RNase加到2XSSC中，混勻，用移液槍將混勻的液體吸起再加到載玻片的染色體上，再剪下PE手套，展開
5、成適當(dāng)大小的薄膜覆蓋在印跡上，避免液體蒸發(fā)，放37℃的濕盒中40min)。2.2XSSC3minX2(揭開薄膜將玻片放在2XSSC的染缸A中，3min后取出將玻片下沿掛的液珠放在幾層的衛(wèi)生紙上吸干，再放在2XSSC染缸B中3min)3.取出，再按照上述的方法吸干液珠，依次放入75%、85%、100%的乙醇2minX3次，晾干4.蛋白酶消化:吸取60μl1XPepsin(現(xiàn)配0.01NHCl:1%pepsin=200:1)加到玻片的印跡上，用PE做成的薄膜覆蓋在上面，37℃溫箱中放15~20min(在加pepsin前，先要混勻,消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同樣品的通透性和探針的種類做預(yù)實(shí)
6、驗(yàn)而定)。5.1XPBS，5min6.固定(取出玻片，放入1%的多聚甲醛的立式染缸里，10min)7.1XPBS，5min8.脫水(三次75%、85%、100%乙醇脫水2minx3次)，晾干9.70%FA變性，73℃，2-3min10.取出，放入預(yù)冷的2XSSC，3minX211.然后，梯度乙醇脫水(75%、85%、100%)2minX3，晾干探針的處理標(biāo)有熒光的探針V1=Va+VbCot-1(封閉中度重復(fù)序列)V2=(1-2倍V1)SSDNA(封閉高度重復(fù)序列)V5=1/10(V1+V2+V5+V6)5μlddH2OV6=50μl-(V1+V2+V5)ΣV1+V2+V5+
7、V650μlNaAc(3mol/l)(沉淀探針)V3=1/10(V1+V2+V5+V6)5μl100%乙醇(-20℃)V4=2X(V1+V2+V3+V5+V6)110μl1在PCR管內(nèi)混勻(以上混合液放在紙盒內(nèi)，不停的轉(zhuǎn)動(dòng)，以使混合液混勻)出現(xiàn)白色沉淀2-80℃，30min-12h注意：有時(shí)還需加鮭魚精(SSDNA)：5μl(封閉高度重復(fù)序列，13、14、15、21、22號(hào)染色體有隨體DNA即有高度重復(fù)序列)312000rpm，4℃，10min，去上清4加適量的-20℃預(yù)冷75%乙醇，12000rpm，4℃，5mi
