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《麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶論文：麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在畢赤酵母中的表達(dá)及活性分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶論文：麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在畢赤酵母中的表達(dá)及活性分析【中文摘要】麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶是一種4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶,能催化直鏈淀粉環(huán)化生成大環(huán)糊精。大環(huán)糊精具有筒狀疏水內(nèi)腔和親水外表結(jié)構(gòu),可以廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)。麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在生物(包括微生物)體內(nèi)含量很低,不能滿足制備大環(huán)糊精和科研的需要。本文從E.coliBL21(DE3)plysS中擴(kuò)增得到麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶基因(MalQ),構(gòu)建了表達(dá)載體pPIC9K-MalQ,SalI線性化,電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115感受態(tài)細(xì)胞中,成功構(gòu)建了一株基因工程菌pPIC9K-Mal
2、Q/GS115。利用0.8%甲醇誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)上清進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基活性分析,TLC結(jié)果顯示表達(dá)上清液具有糖基轉(zhuǎn)移酶作用,證實麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在畢赤酵母中成功表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)生的麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶和直鏈淀粉反應(yīng),制備得到一系列大環(huán)糊精的混合物。本文主要結(jié)論如下：(1)PCR擴(kuò)增得到的MalQ基因,構(gòu)建了表達(dá)載體pPIC9K-MalQ。對其進(jìn)行酶切和測序分析。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對,與GenBank中報道的E.coliBL21(DE3)MalQ基因的同源性為100%。(2)表達(dá)載體用SalⅠ線性化,電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中,構(gòu)建了基因工程菌pPIC9K-MalQ/
3、GS115。0.8%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)上清液與麥芽糖溶液反應(yīng),TLC結(jié)果顯示：上清液具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性。SDS-PAGE電泳顯示,上清液在78.5kDa位置處有明顯條帶,與麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的理論分子量相符。葡萄糖氧化酶法測得表達(dá)上清液酶活118U。證實麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶在畢赤酵母中成功表達(dá)。確定了該酶的最適反應(yīng)溫度為30℃,最適反應(yīng)pH為6.0。(3)基因工程菌pPIC9K-MalQ/GS115的表達(dá)上清液與直鏈淀粉反應(yīng),葡萄糖淀粉酶初步純化,TLC結(jié)果顯示：有聚合度大于9的一系列環(huán)狀糊精生成。證實麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶能催化淀粉生成大環(huán)糊精?！居⑽恼緼mylomal
4、taseisamemberof4-α-Glucanotransferasefamily,catalyzingintramoleculartransglycosylationofα-1,4-glucanstoproducecyclicα-1,4glucans(cycloamyloses).Cyclodextrinwiththestructureofahydrophobicinnercavityandahydrophilicoutsurfacethatlookslikeacolumn.Thesepropertiesarecurrentlyusedinnumerous
5、applicationsinthefood,pharmaceuticalandchemicalindustries.Butitslowcontentinnatureresourcescannotmeettheneedoflibresearchorprodutionofcycloamyloses.GeneMalQwasclonedfromE.coliBL21(DE3)plysS,constructedexpressionplasmidpPIC9K-MalQ.TherecombinantplasmidbearingMalQgenewaslincarizedwithS
6、alIandtransformedintoPichiapastorisstrainGS115.Thepositivecloneswereinducedwithmethanoltoexpressamylomaltase.Thecrudeenzymewasdemonstratedhaving4-α-glucanotransferaseactivitywithTLC.Theamylomaltasealsoproducedcycloamyloseswithamylase.Themainresultsaredescribedasfollows:(1)ThegeneMalQ
7、wasamplifiedfromE.coliBL21(DE3)plysSbyPCR,thenconstructedexpressionplasmidpPIC9K-MalQ.MalQsequencewasanalyzedbyBLASTanditdisplayedhighsimilarity(100%)togeneMalQofE.coliBL21(DE3)plysSreportedintheGenBank.(2)TherecombinantplasmidbearingMalQgenewaslincarizedwithSalIandtransformedintoPic
8、hiapastoriss
