脾臟淋巴細(xì)胞分離方法

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1、小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離方法需要提前準(zhǔn)備的材料：提前高壓滅菌：手術(shù)器械，200目尼龍網(wǎng)，除菌過(guò)濾：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。紅細(xì)胞裂解液，六孔板，培養(yǎng)皿，75%酒精，100ml燒杯，無(wú)菌注射器5-10ml，15ml、50ml離心管，4mlEP管，離心機(jī)等。1、配制的percoll工作液：配制15ml100%percoll液（簡(jiǎn)稱(chēng)工作液）：13.5mlpercoll原液+1.5ml8.5%Nacl溶液混勻備用。2、配制6個(gè)梯度，每個(gè)梯度2ml，實(shí)際配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1ml工作液+0.9ml0.85%N

2、acl溶液混勻備用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8ml工作液+1.2ml0.85%Nacl溶液混勻備用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5ml工作液+1.5ml0.85%Nacl溶液混勻備用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2ml工作液+1.8ml0.85%Nacl溶液混勻備用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9ml工作液+2.1ml0.85%Nacl溶液混勻備用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6ml工作液+2.4ml0.85%Nacl溶液混勻備用找一只15ml離心管，從低到高（20%percoll液→70%

3、percoll液）依次裝入，裝好備用。3、小鼠脾臟細(xì)胞分離（1）頸椎脫臼處死小鼠。75%酒精浸泡10min（2）無(wú)菌條件下取出小鼠脾臟，去除筋膜等置于Hanks’液中，將脾臟放入2ml離心管中剪碎。（3）將200目尼龍網(wǎng)置于六孔板上，用注射器頭研磨，過(guò)程中不停加Hanks’液沖洗。（4）收集脾細(xì)胞懸液置于離心管中，1500rpm10min，棄上清。（5）加10ml？紅細(xì)胞裂解液混懸沉淀，室溫靜置10min，再1500rpm10min（6）洗三遍，1500rpm5min，離心去上清（7）加入2ml0.85%Nacl溶液混懸沉淀。（8）用注射器緩慢沿著事先準(zhǔn)備好的梯度分離管中，水平離心1800-2

4、000rpm30-40min（9）收集想要的分層，用1xPBS洗3遍（10）用完全RPMI-1640培養(yǎng)基混懸沉淀，（調(diào)成濃度為1×108/ml的細(xì)胞懸液）轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中，置37℃，5%CO2下孵育30min后（去除貼壁的細(xì)胞），收獲未貼壁細(xì)胞注：貼壁為單核細(xì)胞（巨噬細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞）不貼壁的懸浮細(xì)胞（T/B/NK細(xì)胞）3/3附件1：(一)　原理　　Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm／kgH２O),粘度也很小，可形成高達(dá)1.3g／ml密度，采用預(yù)先形成的密度梯度時(shí)可在低離心力(200～1000g)于數(shù)分至數(shù)十分鐘內(nèi)達(dá)到滿(mǎn)意的細(xì)胞分離結(jié)果。由于Percoll擴(kuò)

5、散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定。此外，Percoll不穿透生物膜，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，因此廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離?！　?二)操作方法及注意事項(xiàng)　　1.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備:先用9份Percoll與1份8.5％3/3NaCl或1.5MPBS混合達(dá)到生理性滲透壓，然后用生理溶液(0.85％NaCl或0.15MPBS)稀釋到所需濃度?！ercoll濃度(％)　　70　　　　60　　　　50　　　　40　　　　30　　　　　20　　比重g／ml　　　1.0901.0771.0671.0561.0431.0312.　不連續(xù)密度梯

6、度Percoll層的制備:先將試管壁用牛血清濕潤(rùn)，除去多余血清，這種預(yù)處理可使逐層疊加的Percoll液平穩(wěn)沿管壁流下，使形成滿(mǎn)意的界面。在制備過(guò)程中一般用長(zhǎng)針頭注射器從高密度向低密度逐層放置，有時(shí)相鄰兩層Percoll比重相差不大時(shí)，可將Percoll液放入注射器中，小針頭斜面緊貼管壁，任其自然慢慢流下?！　?.　裝樣：樣品體積和細(xì)胞濃度根據(jù)不同細(xì)胞而異，一般加樣體積不宜過(guò)大，細(xì)胞濃度也不可過(guò)高，否則會(huì)影響細(xì)胞的分離和回收。　　4.　離心：一般采用離心力為400g，時(shí)間20～25min。由于多層Percoll之間密度差別不大，因此離心機(jī)加速、降速時(shí)要慢，要平穩(wěn)?！　?.　取樣：當(dāng)所要分離的細(xì)

7、胞絕大部分在兩層的界面時(shí)，可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細(xì)胞;有時(shí)大部分細(xì)胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細(xì)胞經(jīng)2次洗滌后可供培養(yǎng)或檢測(cè)用。　　(三)分離純化細(xì)胞舉例　　1.　富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五種不同密度的Percoll,如用10ml試管(或塑料管)分離,每