aflp分子標(biāo)記技術(shù)

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1、AFLP分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用?一、什么叫AFLP？?二、AFLP的基本原理是什么？?三、AFLP的實(shí)驗(yàn)過(guò)程怎樣？?四、AFLP的應(yīng)用研究如何？?五、對(duì)AFLP的評(píng)價(jià)分子標(biāo)記的歷史：?第一代分子標(biāo)記技術(shù)RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）?第二代分子標(biāo)記技術(shù)RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）nAFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性）?事實(shí)上，還有很多

2、分子標(biāo)記技術(shù)像SSR、ISSR、SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）另外，還有現(xiàn)在號(hào)稱(chēng)為第三代分子標(biāo)記的SNP（單核苷酸多態(tài)性)等AFLP的基本原理?基因組DNA經(jīng)兩種限制性?xún)?nèi)切酶酶切，形成分子量大小不等的隨機(jī)限制性酶切片段，將特定的人工合成的短的雙鏈接頭連在這些片段的兩端，形成一個(gè)帶接頭的特異片段，通過(guò)接頭序列和PCR引物3ˊ端選擇性堿基的識(shí)別，對(duì)特異性片段進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。最后只有那些兩端序列能與選擇性堿基配對(duì)的限制性酶切片段才能被擴(kuò)增；最后將選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，尋找多態(tài)性擴(kuò)增片段。AFLP的實(shí)驗(yàn)流程

3、?模板制備?DNA的提?。⊿DS法和CTAB法）?酶切?連接nPCR擴(kuò)增(PCRAMPLIFIED)?預(yù)擴(kuò)增(Pre-amplified)選擇性擴(kuò)增(Electiveamplified)DNA的提取（SDS法和CTAB法）?SDS是Sodiumdodecylsulfate的縮寫(xiě)稱(chēng)為十二烷基磺酸鈉，?CTAB是Cetyltrimethylammoniumbromide的縮寫(xiě)十六烷基三甲基溴化氨，?兩種都是去污劑，它們都能破壞細(xì)胞膜使膜蛋白變性沉淀，故而使核酸釋放出來(lái)，另外，它還能保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸酶的降解。酶切?為了使酶切片段大小分布

4、均勻，一般采用兩個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶，一個(gè)用6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶(常用EcoRI,、PstI或SacI)，另一個(gè)用4個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶(常用MseI、TaqI)。采用雙酶切的主要原因有：(1)多切點(diǎn)酶產(chǎn)生較小的DNA片段，而切數(shù)點(diǎn)較少的酶能夠減少擴(kuò)增片段的數(shù)目，因?yàn)閿U(kuò)增片段主要是多切點(diǎn)酶和切點(diǎn)數(shù)較少的酶組合產(chǎn)生的酶切片段，這樣就可以減少選擇擴(kuò)增時(shí)所需要的選擇堿基數(shù)。(2)雙酶切可以進(jìn)行單鏈標(biāo)記，從而防止形成雙鏈造成的干擾。(3)雙酶切可以對(duì)擴(kuò)增片段數(shù)進(jìn)行靈活調(diào)節(jié)。(4)通過(guò)少數(shù)引物可產(chǎn)生許多不同的引物組合，從而產(chǎn)生大量的不

5、同的AFLP指紋。這樣，經(jīng)過(guò)酶切后就形成了三種類(lèi)型的酶切片段，如EcoRI/MseI酶切形成EcoRI一EcoRI片段、EcoRI一MseI片段、Mse工一MseI片段，由于AFLP技術(shù)革新成功的關(guān)鍵在于DNA的充分酶切，所以對(duì)模板質(zhì)量要求很高，要注意避免其它DNA污染和抑制物質(zhì)存在。連接?酶切后的DNA片段在T4DNA連接酶作用下與兩種內(nèi)切酶相應(yīng)的特定接頭相連接，形成帶接頭的特異性片段。接頭為雙鏈，由兩部分組成，一部分是核心序列，一部分是酶特定序列(能與酶切片段粘端互補(bǔ))，通常在酶特定序列中變換了一個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基，保證了連接片

6、段不能再被酶切。只有遵循“引物擴(kuò)增原則”設(shè)計(jì)的接頭才能得到滿意的擴(kuò)增結(jié)果。PCR擴(kuò)增(PCRAMPLIFIED)?應(yīng)用與接頭相識(shí)別的引物進(jìn)行擴(kuò)增。AFLP引物由三部分組成：（1）5′端的與人工接頭序列互補(bǔ)的核心序列(coresequence)（2）限制性?xún)?nèi)切酶特定識(shí)別序列(enzyme-specificsequence)（3）3′端的帶有選擇性堿基的粘性末端(selectiveextension)，其中AFLP接頭的設(shè)計(jì)(包括核心序列和酶特定序列)是關(guān)鍵之處，常用的多為EcoRI和MseI接頭，接頭和與接頭相鄰的酶切片段的堿基序列是引物

7、的結(jié)合位點(diǎn)，合成的寡核苷酸接頭經(jīng)過(guò)94℃變性，37℃退火，34℃保存?zhèn)溆?；理論上每增加一個(gè)選擇性堿基，將只擴(kuò)增限制性片段的1/4，而在兩個(gè)引物上都有三個(gè)選擇性堿基的情況下，則僅獲得1/4096的片段；也就是說(shuō)，只有那些兩端序列能與選擇堿基配對(duì)的限制酶切片段被擴(kuò)增。所以選擇性堿基是選擇用于擴(kuò)增的特定的限制性片段的一種精確而有效的方法；n預(yù)擴(kuò)增(Pre-amplified)?擴(kuò)增所用引物3′端有一個(gè)選擇堿基，通過(guò)預(yù)擴(kuò)增對(duì)擴(kuò)增模板進(jìn)行初步篩選，一方面可以避免直接擴(kuò)增造成的指紋帶型背景拖尾現(xiàn)象，另一方面可以避免直接擴(kuò)增由引物3′端3個(gè)選擇堿基誤

8、配形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。?選擇性擴(kuò)增(Electiveamplified)?預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)稀釋后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，使所需模板量不受限制。所用引物3′端有3個(gè)選擇堿基的延伸，通過(guò)3個(gè)選擇堿基的變換獲得豐富的DNA片段。