一株多重耐藥牛源大腸桿菌的分離鑒定

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1、第12期2014年吉林畜牧獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)研究SHiYanYanJiu一株多重耐藥牛源大腸桿菌的分離鑒定1,231111＊孫武文，袁媛，王姣姣，崔冰冰，單曉楓，錢愛東1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.吉林省洮南市動物疫病預(yù)防控制中心，吉林洮南137100；3.長春博瑞飼料集團(tuán)有限公司，吉林長春130114摘要：從吉林省長春市某奶牛場患病犢牛腹瀉樣品中分離一株疑似病原菌，經(jīng)致病性實(shí)驗(yàn)、理化特性觀察、16SrRNA基因序列分析等實(shí)驗(yàn)，證實(shí)該菌為致病性大腸桿菌，并命名為ND131111-1。藥敏試驗(yàn)顯示，菌

2、株ND131111-1對大多數(shù)抗生素具有較強(qiáng)的耐藥性，只有頭孢唑林、頭孢噻肟、磷霉素、呋喃妥因、多粘菌素B等5種抗生素對其敏感，頭孢噻吩對其中度敏感。關(guān)鍵詞：犢牛；腹瀉；大腸桿菌；多重耐藥犢牛腹瀉是新生犢牛的一種急性傳染病，其敏紙片、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自杭州微生物試病原以大腸桿菌為主，該病主要感染10日齡內(nèi)劑有限公司。的犢牛，1～3日齡的犢牛更易發(fā)病，臨床表征以1.1.3實(shí)驗(yàn)動物腹瀉、脫水等為主，也有表現(xiàn)為敗血癥，本病一年昆明系小鼠12只，18g左右/只，購自吉林省[1～3]均可見，但以氣溫較低的冬春多發(fā)。實(shí)驗(yàn)動物中

3、心。2013年11月份，長春某奶牛養(yǎng)殖場發(fā)生一1.2方法起犢牛嚴(yán)重腹瀉的疾病，多種常見藥物治療無1.2.1細(xì)菌的分離效。經(jīng)臨床初步診斷為大腸桿菌引起的犢牛腹取發(fā)病犢牛腹瀉糞樣，無菌操作，接種營養(yǎng)瀉。筆者對發(fā)病犢牛進(jìn)行了病原的分離、鑒定，肉湯中增菌，并于EMB平板和麥康凱瓊脂平板，并對分離菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，為臨床用藥的劃線分離，37℃培養(yǎng)18～24h，挑取特征性菌落選擇以及犢牛腹瀉疾病的防治，提供一些數(shù)據(jù)進(jìn)行純化，4℃保存?zhèn)溆?。支持?.2.2細(xì)菌的致病性試驗(yàn)1材料與方法將純化的細(xì)菌接種于營養(yǎng)肉湯中，培養(yǎng)24h，1.1

4、材料稀釋至1.0×108CFU/mL，以每只0.2mL的劑量接1.1.1病料來源種于小鼠，對照組接種0.2mL的無菌營養(yǎng)肉湯，犢牛腹瀉糞樣取自吉林省長春市某奶牛養(yǎng)每組接種5只，分別飼養(yǎng)，觀察并記錄小鼠發(fā)病殖場，低溫保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。及死亡情況。1.1.2主要試劑1.2.3菌體形態(tài)與理化特性觀察EMB鑒別培養(yǎng)基、MH瓊脂、麥康凱瓊脂、營將1.2.2證明有致病性的細(xì)菌純化并革蘭氏養(yǎng)肉湯購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；TaqDNA染色，觀察菌體形態(tài)；同時將細(xì)菌純培養(yǎng)物接種聚合酶、dNTP、DNAMarker(DL2000)、細(xì)菌

5、基因組于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，具體操作見說明書。提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；藥1.2.416SrRNA基因序列分析取細(xì)菌純培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯，培養(yǎng)，按細(xì)菌基因組提取試劑盒提取其基因組DNA，并以此為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為細(xì)菌通用引*通訊作者物，反應(yīng)條件：94℃5min；94℃1min；55℃1min，實(shí)驗(yàn)研究吉林畜牧獸醫(yī)2014年第12期ZHSuHainYLaunnYZaonnJgiuSHu72℃1min，30循環(huán)；最后72℃10min，取PCR產(chǎn)M1物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR產(chǎn)物提交于TaK

6、aRa公司，完成測序。2000bp測序結(jié)果通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)1000bp行序列相似性比較，并結(jié)合菌體形態(tài)與理化特性750bp進(jìn)行細(xì)菌的最終鑒定。500bp1.2.5藥敏試驗(yàn)250bp8將細(xì)菌稀釋成1×10cfu/mL濃度，取0.1mL100bp菌液涂布于MH平板上，干燥后貼上藥敏紙片，37℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈并測量抑菌圈直徑。圖1菌株ND131111-116SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果判定結(jié)果參照CLSI制定的藥敏標(biāo)準(zhǔn)。2.5藥物敏感性試驗(yàn)2結(jié)果表2為大腸桿菌ND131111-1對22種抗生素2.1

7、菌落形態(tài)觀察的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，從表中可以看出，該菌對大部分離細(xì)菌在EMB瓊脂平板長成圓形、中等分抗生素強(qiáng)耐藥，只有頭孢唑林、頭孢噻肟、磷霉大小、黑色呈金屬光澤的菌落；在麥康凱瓊脂平素、呋喃妥因、多粘菌素B等5種抗生素對其敏板上為圓形、中等大小、粉紅色菌落。感，頭孢噻吩對其中度敏感。2.2致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表2大腸桿菌ND131111-1藥敏試驗(yàn)結(jié)果分離菌株經(jīng)小鼠攻毒發(fā)現(xiàn)，該菌對小鼠具有抑菌圈直判定標(biāo)準(zhǔn)判定藥品名稱致病性，試驗(yàn)組小鼠均死亡，對照組無變化。因徑（mm）耐藥（R）中敏（I）敏感（S）結(jié)果氨芐西林0≤1314～16≥

8、17R此，將該株細(xì)菌暫命名為ND131111-1。阿莫西林0≤1314～16≥18R頭孢唑林22≤1415～17≥18S2.3病原菌菌體形態(tài)與理化特性頭孢噻吩15≤1415～17≥18I顯微鏡下，菌體為革蘭氏陰性桿菌、兩端鈍頭孢噻肟30≤1314～22≥23S慶大霉素0≤1213～14≥15R圓、雙在或散在。鏈霉素0≤1112～1