丙型肝炎病毒多表位抗原的原核表達(dá)及免疫原性分析

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1、丙型肝炎病毒多表位抗原的原核表達(dá)及免疫原性分析【關(guān)鍵詞】丙型肝炎病毒;多表位抗原;體液免疫丙型肝炎病毒(HepatitisCVirus,HCV)是經(jīng)血液途徑傳播的一類肝炎病毒。目前全球約有1.7億～2.0億HCV感染者,此感染者中70%～85%可發(fā)展成為慢性感染,病程長達(dá)20～30年[1],約有30%可發(fā)展成為進(jìn)展性肝病,包括肝硬化或肝癌[2]。目前,對HCV慢性感染尚無高效的特異性治療方法,標(biāo)準(zhǔn)治療方案是聚乙二醇干擾素α聯(lián)合利巴韋林治療24～72周,由于干擾素和利巴韋林副作用巨大,使部分患者無法耐受而提

2、前終止治療[3]。因此迫切需要研發(fā)一種有效疫苗來預(yù)防HCV感染。由于HCV復(fù)制力差、感染力弱,基因組高度變異,并且缺乏有效的細(xì)胞和動物感染模型,因此采用傳統(tǒng)方法研制丙肝疫苗難以達(dá)到目的[4]。以抗原表位預(yù)測和人工合成抗原表位基因?yàn)榛A(chǔ)的多表位疫苗是近年來新的研究趨勢[5],表位肽雖然微小,但免疫原性強(qiáng),可以克服主要組織相容性復(fù)合體(majorhistopabilityplex,MHC)分子的遺傳限制,同時(shí)多表位疫苗在誘生細(xì)胞免疫和克服免疫應(yīng)答中的不利因素方面有著獨(dú)特優(yōu)勢,為特異性免疫治療和基因治療奠定了基礎(chǔ)

3、,因此多表位疫苗成為HCV預(yù)防和治療性疫苗的研究突破點(diǎn)。我們將已合成好的HCV十表位抗原復(fù)合體在原核表達(dá)載體pBV220中成功表達(dá),建立了純化技術(shù)路線,并對該多表位抗原的抗原反應(yīng)性做了分析,同時(shí)利用小鼠對其免疫原性進(jìn)行了初步探索?！　?材料和方法　　1.1材料大腸桿菌DH5α均由本實(shí)驗(yàn)室保存,帶有丙型肝炎多表位抗原基因的質(zhì)粒pBV220HCVe由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。限制性內(nèi)切酶購于大連寶生物工程有限公司。純化用分離介質(zhì)購于Pharmacia公司。HCV抗體診斷試劑盒購于英科新創(chuàng)(廈門)生物科技有限公司。丙型肝炎

4、患者陽性血清來自昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院。BALB/c小鼠,雌性,6～8周齡,購于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所靈長類實(shí)驗(yàn)動物中心?！　?.2方法　　1.2.1pBV220HCVe的鑒定將已連好的pBV220HCVe質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,酶切鑒定,篩選陽性克隆?！　?.2.2pBV220HCVe的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化挑取含重組子pBV220HCVe的陽性克隆于含Ampicillin的LB液體培養(yǎng)基中30℃振蕩過夜,次日按1∶100的比率擴(kuò)大培養(yǎng)2～3h后,迅速升溫至42℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4～6h,離心收集菌體,

5、經(jīng)150g/LSDSPAGE檢測,考馬斯亮藍(lán)染色,確定目的蛋白的表達(dá)量及相對分子量大小,挑選表達(dá)量最高的優(yōu)勢菌種劃線涂板,以備后用。溫度誘導(dǎo)菌體經(jīng)超聲波破碎,用1mol/L、2mol/L尿素逐級洗滌包涵體沉淀,離心回收沉淀,將沉淀溶于8mol/L尿素,再用1mol/LDTT和10mmol/LPB緩沖液對洗滌后的蛋白沉淀進(jìn)行稀釋復(fù)性。用硫酸銨分級沉淀方法從復(fù)性液中沉淀濃縮雜蛋白,后經(jīng)SephadexG25脫鹽柱脫鹽、DEAESephroseFastFlow離子交換層析、SephadexS200排阻層析

6、柱純化,150g/LSDSPAGE分析其純度,福林酚法測定蛋白濃度,-20℃保存?zhèn)溆谩！　?.2.3HCVe抗原反應(yīng)性分析將純化的HCVe蛋白進(jìn)行150g/LSDSPAGE電泳,當(dāng)目的蛋白遷移到適合位置時(shí)結(jié)束電泳,將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。以10g/LBSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn),反應(yīng)1h,37℃與丙型肝炎患者陽性血清(1∶50稀釋)結(jié)合,反應(yīng)2h,經(jīng)TTBS清洗3次后,37℃與堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG(1∶50稀釋)結(jié)合,充分洗膜,DAB顯色,觀察結(jié)果?！　?.2.4HCVe免疫效果分析將6～8周

7、齡、雌性BALB/c小鼠,隨機(jī)分為4組,10、50、100μg組,PBS對照組,每組6只。取純化的HCVe蛋白按10、50、100μg組,以氫氧化鋁(1g/L)為佐劑,皮下注射,分別免疫BALB/c小鼠,免疫后1個(gè)月加強(qiáng)免疫1次,共免疫2次。免疫后第2、6、8周采集小鼠尾靜脈血,分離血清,用HCV抗體診斷試劑盒檢測各組實(shí)驗(yàn)組小鼠HCV特異性抗體的產(chǎn)生情況。2結(jié)果　　2.1pBV220HCVe重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒pBV220HCVe經(jīng)過EcoRI酶切后,得到501bp的預(yù)期片段(圖1)。序列測定結(jié)果與設(shè)

8、計(jì)序列完全一致?！　?.3HCVe抗原反應(yīng)性分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上的HCVe蛋白可與特異性抗體結(jié)合,表明重新構(gòu)建的HCVe蛋白具有良好的特異性HCV抗原反應(yīng)性(圖3)?！　?.4HCVe免疫效果分析采用HCV抗體診斷試劑盒檢測實(shí)驗(yàn)小鼠HCV特異性抗體產(chǎn)生情況,表明各劑量組在HCVe第1次免疫后2周,各劑量組小鼠均產(chǎn)生抗HCV特異性抗體,2免后第1次采血檢測(第6周)10μg及50μg劑量組小鼠特異性抗體