不同糖濃度對體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞增殖、分化的影響

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1、不同糖濃度對體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞增殖、分化的影響　　Abstract：ObjectiveTofindtherelationshipbetousefibroblastountoftheoutcelltypeIcollagenfibersousetypeIcollagenElisakit,andtheexpressionofαsmoothmuscleactin(αSMA)testedbyimmunochemistry.ResultsA,positivecorrelationouseαSMA.ConclusionAttheoriginalaugmentation

2、ofthebloodglucose,theproliferationoffibroblastisnotdifferent.Butfibroblasttomyofibroblast,andtheconcentrationofglucoseispositivelycorrelatedoothmuscleactin,αSMA）被普遍認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞表型的可靠證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，在體外模擬高血糖的環(huán)境，設(shè)定不同糖濃度，研究不同時(shí)間下成纖維細(xì)胞生長增殖情況和膠原合成情況，從而為了解不同糖濃度下成纖維細(xì)胞增殖情況奠定體外試驗(yàn)基礎(chǔ)?！　〔牧吓c方法　　1主要試劑

3、　　胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基（購自Gibico），CellCountingKit8試劑盒(購自碧云天試劑公司)，羊抗小鼠I型膠原抗體，羊抗小鼠肌動蛋白單克隆抗體（購自Santa），兔抗羊二抗（購自Santa）小鼠I型膠原ELISA試劑盒（購自Sygma）?！　?實(shí)驗(yàn)方法　　2.1成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)取健康試驗(yàn)用家鼠（昆明小鼠），處死后將背部皮膚毛發(fā)刮去，酒精消毒，取3cm×3cm大小皮膚，用無菌剪刀剪去皮下脂肪組織，將皮膚剪碎后散落在無菌培養(yǎng)皿中，加入含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1周左右，帶成纖維細(xì)胞遷出組織塊后，剔去大塊組織，繼續(xù)培養(yǎng)，并傳代多

4、次后純化等到成纖維細(xì)胞?！　?.2不同濃度糖培養(yǎng)液的制備普通高糖DMEM培養(yǎng)基葡萄糖含量為25mmol/L（每升培養(yǎng)基含葡萄糖4500mg），加入一定量左旋葡萄糖后過濾，配置成糖濃度梯度為25、40、55、70、85mmol/L的培養(yǎng)液，其滲透壓按照分別為5311、5603、5896、6181、6474mmHg，在正常值5311～6227mmHg范圍內(nèi)或稍高。依次為A、B、C、D、E5個(gè)糖濃度組，按照普通組即A組相當(dāng)于正常血糖值餐后高值7mmol/L，即各組相當(dāng)于血糖值的7.0、11.2、15.4、19.6、23.8mmol/L?！　?.3成纖維細(xì)胞的鑒定和Ⅰ型膠原

5、的組織學(xué)觀察采用爬片法，使成纖維細(xì)胞在特制放滑玻片上生長，待細(xì)胞生長到約占70％時(shí)，取出玻片，采用細(xì)胞免疫組化法（一抗為羊抗鼠I型膠原單克隆抗體，二抗為兔抗羊單克隆抗體）染色（購自Santa）?！　?.4成纖維細(xì)胞增殖的CCK測定使用CCK8試劑盒檢測(購自碧云天試劑公司)。將細(xì)胞消化后加入到96孔板中，每孔加入100μl2000個(gè)細(xì)胞，過夜，待細(xì)胞貼壁生長后用A、B、C、D、E5個(gè)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)，時(shí)間為12、24、48小時(shí)，每孔加入10μlCCK8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5～4小時(shí)，在450nm測定吸光度（其細(xì)胞數(shù)量和吸光度成正比）?！　?.5成纖維

6、細(xì)胞I型膠原的Elisa測定將細(xì)胞消化下后，按照細(xì)胞數(shù)1×104個(gè)/孔接種到48孔板中，過夜，待細(xì)胞貼壁生長后用A、B、C、D、E5個(gè)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)，時(shí)間為12、24、48小時(shí)，然后用移液管反復(fù)吹打孔底，吸上清，用鼠I型膠原Elisa試劑盒測定細(xì)胞外膠原的濃度?！　?.6成纖維細(xì)胞肌動蛋白的Westernblot將細(xì)胞消化下后，按照同樣的濃度接種到48孔板中，過夜，待細(xì)胞貼壁生長后用A、B、C、D、E5個(gè)濃度的培養(yǎng)液培養(yǎng)，時(shí)間為12、24、48小時(shí)，吸去上清后將培養(yǎng)皿放置在冰上，假如蛋白提取液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，測定蛋白濃度，經(jīng)過煮沸、制膠、蛋白上樣，冰上電泳后轉(zhuǎn)膜

7、，封閉，加入一抗小鼠肌動蛋白單克隆抗體（購自Santa）和二抗兔抗羊二抗（購自Santa）后，孵育，洗膜，曝光，檢測肌動蛋白。　　3統(tǒng)計(jì)分析　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(onewayANOVA)?！　〗Y(jié)果　　1成纖維細(xì)胞的鑒定和I型膠原的組織學(xué)觀察　　如圖1為未加入一抗的對照組，不僅細(xì)胞未被染色，而且細(xì)胞間未觀察到有被染色的I型膠原，這一點(diǎn)提示成纖維細(xì)胞所分泌之I型膠原纖維可能被吹打脫離培養(yǎng)瓶底部，或在體外培養(yǎng)中成纖維細(xì)胞分泌I型膠原較少。圖2所示，加入一抗和二抗的樣本中，成纖維細(xì)胞被染成棕色，細(xì)胞成多邊形和長梭形，細(xì)胞較大；證實(shí)原代培養(yǎng)