改變組織醛固酮及其受體表達(dá)對(duì)shr大鼠腎臟纖維化的影響

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1、改變組織醛固酮及其受體表達(dá)對(duì)SHR大鼠腎臟纖維化的影響：成彩聯(lián)，婁探奇，湯穎，石成鋼，陳珠江【摘要】【目的】觀察改變腎組織醛固酮及其受體水平對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化的影響?！痉椒ā?周齡的雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）24只及同源正常京都大鼠（ASSON染色，參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行評(píng)分，200倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選擇腎組織內(nèi)5個(gè)腎小球，利用圖像分析系統(tǒng)，首先檢測(cè)腎小球總面積，再檢測(cè)相應(yīng)腎小球內(nèi)膠原的總OD(光密度)值（藍(lán)色代表膠原纖維），計(jì)算膠原纖維OD/腎小球總面積，代表膠原纖維的含量。1.2.6腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和醛固酮受體mRNA采用RT-PCR方法

2、，TRIZOL試劑購(gòu)于InvitrogenLifeTechnologies公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自晶美生物公司，PCR反應(yīng)預(yù)混液購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。取總量為4?滋g的總RNA，以RandomPrimer為引物合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增條件：GAPDH（725bp）：94℃2min，94℃30s，52℃30s，72℃45s，72℃10min，32個(gè)循環(huán)；TGF-β1（432bp）：94℃2min，94℃30s，52℃30s，72℃45s，72℃10min，32個(gè)循環(huán)；MR（486bp）：94℃2min，94℃1mi

3、n，49℃1min，72℃1min，72℃10min，35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)溴化乙錠染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，全自動(dòng)凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)掃描照相，分析電泳帶的灰度，以與內(nèi)參照GAPDH的條帶密度A值之比半定量表達(dá)水平。1.2.7腎組織TGFβ1和醛固酮受體蛋白采用免疫組化方法，兔抗大鼠TGF-β1單克隆抗體（使用濃度為1∶100）購(gòu)自SantaCruz公司，抗兔SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山生物有限公司，山羊抗大鼠醛固酮受體多克隆抗體（使用濃度為1∶50）及抗山羊SABC免疫組化試劑盒均購(gòu)自SantaCruz公司。用德國(guó)KONTRONIBAS

4、2.5全自動(dòng)圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化結(jié)果定量分析[5]。1.3統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS11.0，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊資料采用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較，等級(jí)資料采用秩變換分析方法進(jìn)行比較，α=0.05。2.3臨床指標(biāo)高血壓對(duì)照組大鼠自實(shí)驗(yàn)開始時(shí)（8周齡）已出現(xiàn)高血壓，此后，隨著周齡增大，血壓逐漸升高，在觀察時(shí)間為8周（16周齡）時(shí)血壓已升至180mmHg左右，出現(xiàn)明顯的蛋白尿和低白蛋白血癥(P<0.05)，血尿素氮和肌酐水平與正常對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別

5、(P>0.05)，正常對(duì)照組大鼠整個(gè)觀察時(shí)間內(nèi)都沒(méi)有出現(xiàn)高血壓。貝那普利干預(yù)后，血壓逐漸下降，尿蛋白明顯降低（P<0.05），血白蛋白水平升高（P<0.05）；大劑量安體舒通干預(yù)后，血壓沒(méi)有明顯改變(P>0.05)，尿蛋白升高（P<0.05），血白蛋白減少（P<0.05）；血尿素氮和肌酐水平在各組間無(wú)明顯區(qū)別（P>0.05），見(jiàn)表2。2.4病理指標(biāo)與正常對(duì)照組相比，高血壓對(duì)照組可以看到蛋白管型，小管擴(kuò)張，管周炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球內(nèi)膠原形成增多（P<0.05）；貝那普利干預(yù)后，腎小球內(nèi)膠原形成明顯減少（P<

6、0.05）；安體舒通干預(yù)后，膠原形成明顯增多（P<0.05），見(jiàn)圖3和表3。2.5腎組織TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)高血壓對(duì)照組腎組織TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)比正常對(duì)照組高（P<0.05），貝那普利干預(yù)后，腎組織TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)較高血壓對(duì)照組明顯降低（P<0.05）；大劑量安體舒通干預(yù)后，腎組織TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高，與高血壓對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），見(jiàn)圖4、圖5和表3。3討論腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)對(duì)體內(nèi)體液平衡和血壓調(diào)節(jié)起著主要作用，醛固酮是有絲分裂和膠原合成的強(qiáng)烈刺

7、激劑，可以促進(jìn)心肌和腎臟纖維化[6]。醛固酮受體作為其中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，可能在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR組大鼠血壓升高，尿蛋白明顯增多，白蛋白明顯下降，腎小球內(nèi)膠原沉積增多，血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、小管擴(kuò)張、蛋白管型、腎臟損傷明顯，腎臟的TGFβ1mRNA和蛋白表達(dá)也比正常對(duì)照組高，提示高血壓可導(dǎo)致腎損傷和腎臟纖維化。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)觀察到SHR組大鼠血漿和組織的醛固酮水平及腎組織的醛固酮受體mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組。Delano等[7]亦觀察到自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜毛細(xì)血管上醛固酮受體的密度高于正常對(duì)照組，導(dǎo)致對(duì)醛固酮

8、的反應(yīng)升高的報(bào)道相符。由此我們?cè)O(shè)想，腎組織醛固酮及其