大鼠ige依賴組胺釋放因子基因的克隆表達(dá)及其功能研究

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1、大鼠IgE依賴組胺釋放因子基因的克隆表達(dá)及其功能研究：陳曉湘,胡旭初,徐勁,鄭南才,余新炳【摘要】　　目的:獲得原核表達(dá)的可溶性大鼠IgE依賴組胺釋放因子（rHRF）,并檢測(cè)其誘發(fā)大鼠致敏肥大細(xì)胞釋放組胺的功能。方法:克隆r）約為24000;重組rHRF誘發(fā)大鼠致敏肥大細(xì)胞釋放組胺不依賴變應(yīng)原,且呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論:rHRF具有不依賴變應(yīng)原誘發(fā)大鼠致敏肥大細(xì)胞釋放組胺的功能,可能在Ⅰ型超敏反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用,為進(jìn)一步研究rHRF的免疫學(xué)功能打下基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】大鼠IgE依賴組胺釋放因子基因克隆原核表達(dá)肥大

2、細(xì)胞組胺　　[Abstract]AIM:TocloneandexpressthegeneencodingratIgEdependenthistaminereleasingfactor(rHRF)andtostudytheeffectofrebinantrHRFtoinducehistaminereleasefromratsensitizedmastcells.METHODS:ThepletecodingregionofrHRFastcellsobtainedfromthelungsofOVAimmuniz

3、edratsulatedbyrebinantrHRFatdifferentconcentration.ThereleasedhistamineeasuredbytheOPTspectrofluorometricprocedure.RESULTS:TheclonedDNAfragmentshoinoacidsequenceidentityRNAofratIgEdependenthistaminereleasingfactor(ortranslationallycontrolledtumorprotein)in

4、GenBank.TherebinantrHRFshoinereleasingfromthesensitizedmastcellsinadosedependentmanner.CONCLUSION:TherebinantrHRF,inereleasefromsensitizedmastcells,portantroleintheallergendiseases.　　[Keyinereleasingfactor;genecloning;prokaryoticexpression;mastcell;histami

5、ne　　組胺釋放因子是一大類具有促進(jìn)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺等介質(zhì)的生物活性物質(zhì)的總稱。根據(jù)發(fā)揮作用時(shí)對(duì)IgE依賴與否,可分為IgE非依賴性和IgE依賴性兩類。1995年MacDonald等[1]從人巨噬細(xì)胞系U937培養(yǎng)上清中鑒定出一種IgE依賴組胺釋放因子,并證實(shí)其與人的翻譯控制腫瘤蛋白（translationallycontrolledtumorprotein,TCTP）為同一蛋白,與小鼠TCTP氨基酸序列具有94%同源性。IgE依賴組胺釋放因子可促進(jìn)嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺、IL4、IL13[2]

6、;促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌免疫球蛋白[3];促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞釋放IL8[4,5],同時(shí)發(fā)揮嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子作用[4],引起局部炎癥細(xì)胞聚集。因此認(rèn)為該蛋白在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。肥大細(xì)胞是Ⅰ型超敏反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞,激活后釋放組胺等多種介質(zhì)。關(guān)于IgE依賴組胺釋放因子對(duì)肥大細(xì)胞的作用未見報(bào)道。本研究旨在獲得大鼠IgE依賴組胺釋放因子（ratIgEdependenthistaminereleasingfactor,rHRF）重組蛋白,觀察其誘發(fā)大鼠致敏肥大細(xì)胞釋放組胺的功能,為

7、以大鼠為模型進(jìn)一步探討IgE依賴組胺釋放因子在Ⅰ型超敏反應(yīng)發(fā)生過程中的作用奠定基礎(chǔ)。　　1材料和方法　　1.1材料109、BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存;核酸電泳Mr標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)電泳Mr標(biāo)準(zhǔn)、限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI、T4DNA連接酶、ExTaqDNA聚合酶、dNTP及PMD19Tsimplevector試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京賽百勝公司;TRIzol、Ⅰ型膠原酶為Invitrogen公司產(chǎn)品;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品;His·Tag

8、融合蛋白親和純化試劑盒為Novegen公司產(chǎn)品;卵清蛋白（Ⅴ級(jí)）、透明質(zhì)酸酶、組胺標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品;氫氧化鋁佐劑為武漢中博生化有限公司產(chǎn)品;鄰苯二甲醛（OPT）為上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;引物設(shè)計(jì)由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成?！　?.2方法　　1.2.1大鼠肝組織總RNA的提取無(wú)菌操作取大鼠肝組織,總RNA提取按照TRIzol試劑說(shuō)明書步驟進(jìn)行?！　?.2.2逆轉(zhuǎn)錄