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1、蜂膠佐劑對E.coli多價(jià)滅活苗免疫小鼠效果的實(shí)驗(yàn)研究 免疫佐劑可增強(qiáng)抗原所激發(fā)的抗體應(yīng)答,可提高免疫原性,以及增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的非特異性殺傷功能和特異性細(xì)胞免疫的刺激作用等。因此,佐劑是疫苗特別是滅活疫苗所必不可少的成分。蜂膠作為一種具有生物活性的免疫佐劑所顯示出的優(yōu)點(diǎn)已逐漸被認(rèn)識(shí)［1］。蜂膠具有廣譜生物學(xué)活性,是一種良好的免疫增強(qiáng)劑和刺激劑［2］,它既能引起特異性免疫應(yīng)答,又能啟動(dòng)非特異性防御機(jī)制,有增強(qiáng)免疫抗體生成和提高白細(xì)胞吞噬能力的明顯效果［3］。 1材料和方法 1.1材料 致病性大腸桿菌O2、O78由華西醫(yī)學(xué)院提供。O157菌株由本醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。改良
2、沙氏培養(yǎng)基、厭氧肉肝湯、三氯化鋁、氫氧化鈉、甲醛、9g/L氯化鈉、蜂膠等購自大連寶生物工程有限公司。小白鼠(質(zhì)量18～22g,60只,雌雄各半)由本醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。 1.2方法 1.2.1小白鼠致死性試驗(yàn) 致病性大腸桿菌O2、O78及O157分別接種到伊紅美藍(lán)培養(yǎng)液上,37℃培養(yǎng)18～24h。取單菌落接種到5mL肉湯中,37℃、200r/min過夜。分別接種質(zhì)量18～22g小白鼠5只,每只腹腔注射0.5mL菌液,并設(shè)注射同批無菌肉湯培養(yǎng)液的5只小白鼠作對照,隔離飼養(yǎng),觀察小白鼠發(fā)病和死亡情況?！ ?.2.2菌苗液培養(yǎng)及純粹檢驗(yàn) 將致病性大腸桿菌O2、O7
3、8及O157分別接種于牛肉湯內(nèi),37℃培養(yǎng)備用。將上述3種培養(yǎng)液等量混合,按1％的量接種肉湯的錐型瓶內(nèi),37℃培養(yǎng)24h,其間搖8次/2min,此時(shí)大腸桿菌含量最高,及時(shí)計(jì)數(shù)及滅活。取培養(yǎng)好的菌液,作檢驗(yàn),每瓶樣品需用改良沙氏培養(yǎng)基,馬丁肉湯瓊脂斜面管2支,每支接種擴(kuò)大培養(yǎng)液0.2mL;另用50mL的厭氣肉肝湯和馬丁肉湯各1瓶,分別接種擴(kuò)大培養(yǎng)液0.5～1mL。37℃培養(yǎng)7d,觀察細(xì)菌生長情況?！ ?.2.3活菌計(jì)數(shù)、甲醛滅活及無菌檢驗(yàn) 取菌液1mL,按常規(guī)稀釋法將菌液連續(xù)10倍稀釋,取10-9、10-10兩個(gè)稀釋度用1mL無菌吸管取2個(gè)稀釋度的菌液1mL,接種于普通
4、瓊脂培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24h,次日數(shù)菌。按菌液總量的0.4％加入甲醛溶液（按含甲醛40％折算加入）,搖勻后,于37℃搖振培養(yǎng)殺菌2～4d。取滅活好的菌液,接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基上,同時(shí)接種厭氣肉肝湯,37℃培養(yǎng)3～5d,觀察有無細(xì)菌生長。若未見細(xì)菌生長則判為合格。檢驗(yàn)合格后4℃保存,待配疫苗?！ ?.2.4佐劑和疫苗的制備 (1)氫氧化鋁膠的制備:取25g無水AlCl3配成250mL/L溶液,使用時(shí)將其稀釋成80mL/L。另將NaOH配成40mL/L溶液。將AlCl3溶液與Al(OH)3溶液混合高壓滅菌,pH5.5。(2)蜂膠的制備:取蜂膠磨碎,溶解于9
5、50mL/L的分析純乙醇中形成過飽和的蜂膠乙醇溶液作為制苗的佐劑,2h搖動(dòng)1次,2min/次。(3)氫氧化鋁膠佐劑滅活苗的制備按菌液5∶1的比例加入滅菌處理過的氫氧化鋁膠和0.1g/L的硫柳汞,靜置3～4d,4℃保存。(4)蜂膠佐劑滅活苗的制備:100mL滅活菌液中加入3mL蜂膠提純液,充分搖勻后4℃保存?！ ?.2.5無菌、安全性及穩(wěn)定性檢驗(yàn) 取滅活好的菌液,37℃培養(yǎng)3d,觀察有無細(xì)菌生長。取15只18～22g小白鼠,隨機(jī)分成3組,一組為對照組,試驗(yàn)組分別接種2種疫苗,每只腹腔注射0.5mL,對照組腹腔注射0.5mL生理鹽水。觀察1周,記錄臨床癥狀和注射部位病變,
6、并于試驗(yàn)期末活檢受試鼠,觀察疫苗吸收狀況。將疫苗置于4℃保存1個(gè)月,觀察性狀有無變化?！ ?.2.6小白鼠最小免疫劑量的測定 質(zhì)量為18～22g的小白鼠50只分成2批,每批25只小白鼠,每批分為5組,每組5只,每批分別腹腔注射氫氧化鋁膠滅活疫苗和蜂膠滅活疫苗0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL;同時(shí)設(shè)對照5只,注射生理鹽水。10d后用E.coliO2、O78及O157混合菌液攻擊,每只小鼠腹腔注射菌液0.5mL（5～8×1010CFU/L）,觀察并記錄小白鼠發(fā)病狀況,測定其保護(hù)率(表1)。表1小白鼠最小免疫劑量的測定試驗(yàn)結(jié)果（略） 1.2.7效力檢驗(yàn) 質(zhì)量為
7、18～22g的小白鼠50只分成2批,每批25只小白鼠,每批分為5組,每組5只,每批分別腹腔注射蜂膠滅活疫苗和氫氧化鋁膠滅活疫苗0.3mL和0.5mL,同時(shí)設(shè)對照5只,注射生理鹽水接種后于第10天連同對照組用E.coliO2、O78及O157混合菌液攻擊,每只小鼠腹腔注射菌液0.5mL（5～8×1010CFU/L）,觀察1周,對發(fā)病與死亡小鼠剖檢和檢菌。求出疫苗的疫苗保護(hù)率=保護(hù)數(shù)/攻毒數(shù)×100%（表2）?！ ?結(jié)果 2.1菌種毒力鑒定及活菌計(jì)數(shù) 腹腔注射菌液的小白鼠在1d內(nèi)全部死亡,解剖癥狀為急性敗血性病變,說明所選用菌株為強(qiáng)毒株,
