氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及其降解特性研究

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1、氯氰菊酯降解菌的分離鑒定及其降解特性研究【摘要】目的分離得到能高效降解氯氰菊酯的菌株。方法采用選擇性培養(yǎng)基從農(nóng)藥廠的污泥中進(jìn)行富集和分離篩選高效菌株，并且用16SrDNA序列分析法和其生理生化特征對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果該菌株鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)，命名為Klebsiellasp.J2（登錄號(hào)為AY989899），菌株J2能以氯氰菊酯為唯一碳源進(jìn)行生長，降解氯氰菊酯的最適溫度是35℃,最佳pH是7.0。結(jié)論菌株J2是一株能高效降解氯氰菊酯的菌株?！娟P(guān)鍵詞】氯氰菊酯；克雷伯氏菌；生物降解　　　　Abstract:ObjectiveToi

2、solateabacterialstrainJ2capableofdegradingcypermethrinfromsludgeofapesticidemanufacturer.MethodsAdoptingselectiveculturetoscreenandisolatethecypermethrindegradingstrainfromthesamplesandidentifyingthestrainbyusingthe16SrDNAsequenceanalysisanditstaxonomiccharacteristics.ResultsThisb

3、acterialstrainedJ2.Itcouldgroethrinassolesourceofcarbon.TheoptimaltemperatureandpHofcypermethrindegradationbytheorganismethrin.　　Keyethrin；Klebsiellasp.J2；biodegradation　　隨著20世紀(jì)80年代無機(jī)鹽農(nóng)藥和有機(jī)氯農(nóng)藥的相繼禁用，菊酯類農(nóng)藥已發(fā)展為我國現(xiàn)階段使用最廣泛的農(nóng)藥之一，由于具有廣譜、內(nèi)吸、觸殺等高效殺蟲特性，因此廣受農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者歡迎。但是，大量使用引起的農(nóng)藥殘留不僅造成環(huán)境與食品的污染

4、，而且影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量及人們的身體健康。農(nóng)藥殘留及其廢水的降解主要有微生物降解、化學(xué)降解和光降解等方式。與其他的降解方式相比，微生物降解具有操作簡單、降解徹底、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。因此利用微生物技術(shù)處理農(nóng)藥殘留，并對(duì)受污染的土壤與水體進(jìn)行生物修復(fù)是一種行之有效的方法。目前對(duì)有機(jī)磷和有機(jī)氯等農(nóng)藥的微生物降解的研究比較多，而關(guān)于菊酯類農(nóng)藥的降解研究較少。本文從農(nóng)藥廠的污泥中采集土壤樣品，篩選分離到一株能高效降解氯氰菊酯的菌株（J2），并對(duì)其進(jìn)行篩選、鑒定及降解性能的初步研究［13］。　　1材料與方法　　1.1培養(yǎng)基　　富集培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g、NaCl2

5、.0g、KH2PO41.5g、葡萄糖1.0g、dH2O1000mL，pH值7.0；經(jīng)115℃，滅菌20min?；九囵B(yǎng)基（1L）：NH4Cl1.0g，KH2PO40.5g，K2HPO41.5g，MgSO40.2g，NaCl0.5g，加入氯氰菊酯作為唯一碳源，濃度視需要添加。LB液體培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，pH值7.0（固體加2%的瓊脂粉）。　　1.2實(shí)驗(yàn)試劑　　氯氰菊酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%）原藥和標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%，色譜純）購自成都化學(xué)試劑公司；TaqDNA聚合酶與各種限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物；3SDNAGelPur

6、ificationkitV3.1購自上海申能博彩生物科技有限公司；PCR引物由上海博亞合成；pMD18T載體試劑盒購自大連寶生物?！　?.3降解菌株的富集和分離　　將采集的農(nóng)藥污染土樣配制成15%的懸浮液，以5%的接種量接到含25mg/L氯氰菊酯的富集培養(yǎng)基中，并加適量玻璃珠，37℃、160r/min振蕩培養(yǎng)。待菌長出后，取1mL菌液接入同樣培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，傳代過程中氯氰菊酯的濃度逐步增高至300mg/L,大約2d傳代1次。將富集的農(nóng)藥降解菌菌液用無菌水作10倍梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6）稀釋，分別取0.2mL懸液涂

7、布在含有50mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)；當(dāng)平板出現(xiàn)菌落時(shí)，將單菌落在無機(jī)鹽農(nóng)藥平板上劃線分離、純化菌株。將生長快、菌落規(guī)則、傳代穩(wěn)定的單菌落斜面保存。將初篩純化的斜面單菌落接入含有50mg/L氯氰菊酯的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基,37℃、160r/min培養(yǎng)2d，測(cè)定其降解率?！　?.4菌株的鑒定　　菌株的形態(tài)及生理生化特性參照　　2.3菌株16SrDNA的序列分析　　以菌株J2的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為1514bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖1），測(cè)序后在GenBank上登錄，登錄號(hào)為AY989899。根

8、據(jù)同源性比較，菌株J2與Geneba