中藥血清藥理學(xué)研究方法探討與思考

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1、中藥血清藥理學(xué)研究方法探討與思考作者：韓林賈波石含秀沈濤由鳳鳴【關(guān)鍵詞】中藥血清藥理學(xué)研究方法中藥血清藥理學(xué)是指將中藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動物灌服一定時間后采集動物血液，分離血清,用含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實驗的一種實驗技術(shù)。1988年日本學(xué)者田真代一[1]提出了血清藥理學(xué)的概念和實驗方法。國內(nèi)20世紀(jì)90年代初開始探索，近10年來此法越來越多地應(yīng)用于中藥藥理的研究。1中藥血清藥理學(xué)研究方法現(xiàn)狀1．1動物模型制備1.1.1實驗動物選擇不同種屬的動物,血清成分不同,人與動物血清更存在差異。陸慧晶[2]認(rèn)為,選

2、擇動物時應(yīng)盡量選與人類生物特性近似的物種,制備血清的動物應(yīng)與獲取離體器官、組織細(xì)胞的動物相一致,從而縮小或避免動物血清之間以及動物血清和人類血清之間在理化、生物等特性上的差異,提高實驗結(jié)果的可靠性。劉成海等[3]提出,在體外培養(yǎng)實驗中宜采用同一種單一血清,既為細(xì)胞提供營養(yǎng),又為藥物載體,還避免了多種血清的干擾。動物常采用大鼠小鼠、兔、豚鼠等來制備血清。一般家兔和大鼠應(yīng)為首選。1.1.2離體組織(細(xì)胞)選擇體外培養(yǎng)細(xì)胞的供體動物與含藥血清的供體動物應(yīng)同種屬。因為實驗是要在體外盡可能準(zhǔn)確的再現(xiàn)在體實驗時藥物與

3、機(jī)體相互作用的整個過程,所以應(yīng)盡可能減少因動物種屬差異而造成的免疫反應(yīng)。因此,在體外培養(yǎng)實驗中宜采用同種單一血清,既為細(xì)胞提供營養(yǎng),又為藥物載體,還避免了多種血清的干擾[4]。1.2動物給藥方案1.2.1給藥途徑一般多用口服(灌胃)給藥方式制備含藥血清,由于中藥新型制劑不斷產(chǎn)生,也可以用注射、皮膚、粘膜、呼吸等給藥途徑來試驗制備含藥血清。一般在制備含藥血清時,供體動物的給藥途徑應(yīng)該與臨床給藥途徑一致，以避免由于給藥途徑的不同帶來結(jié)果的差異[5]。1.2.2給藥劑量血清藥理學(xué)很重要的一個問題是給藥劑量的確定

4、,合適的給藥劑量,對保證實驗的成功很重要。給藥劑量目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因含藥血清加入反應(yīng)體系后,濃度被稀釋,使反應(yīng)體系的濃度達(dá)不到在體條件下的藥物濃度。王力倩等6]發(fā)現(xiàn),以參考公式:給藥劑量=臨床常用量×動物等效面積系數(shù)×培養(yǎng)基內(nèi)血清稀釋度,計算給藥劑量,得到的含藥血清對腫瘤細(xì)胞體外生長有抑制作用,而比上述參考公式計算的給藥量小1倍量的含藥血清無明顯作用。在這種情況下,如果反應(yīng)體系出現(xiàn)陰性反應(yīng),并不能排除藥物濃度過低而出現(xiàn)的假陰性反應(yīng)。李儀奎等[7]提出兩種方法:一是增大給藥劑量,即給藥劑量=在體實驗的給藥

5、劑量×反應(yīng)體系中被稀釋倍數(shù)(同上述王力倩所提參考公式)。然而,其不足之處是給藥劑量與血藥濃度并不是呈等比增加,況且受到灌胃藥物濃度和體積的限制。二是按新藥藥理研究的技術(shù)要求設(shè)計劑量給藥,將含藥血清制成冷凍干燥粉,以凍干粉形式加入反應(yīng)體系使其達(dá)到所需濃度。其優(yōu)點是:根據(jù)需要提高體外反應(yīng)體系中的含藥濃度或形成等容,有利于血清的儲藏保存。王寧生等[8]認(rèn)為,給藥劑量以整體模型動物的有效劑量8～18倍為宜。筆者認(rèn)為，實驗給藥劑量,最好通過預(yù)實驗解決。1.2.3給藥次數(shù)與時間間隔目前常用的方法有:1次給藥或間隔2～

6、4小時給藥，或1天1～3次,連續(xù)3～10天。根據(jù)藥代動力學(xué)理論,以固定給藥時間間隔,相同劑量多次重復(fù)給藥后血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài),并將在穩(wěn)態(tài)下不同采血時間取得的含藥血清進(jìn)行實驗,均表現(xiàn)較高而且相似的藥理作用強度。孟李[9]就復(fù)方丹參血清對中性粒細(xì)胞釋放活性氧的影響,探討含藥血清制備方法的實驗,證實了此觀點。說明同一給藥方案連續(xù)數(shù)日給藥較1次給藥有明顯差異,與藥物誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生內(nèi)源性生物活性物質(zhì)有關(guān)[10]。此結(jié)論目前已成共識。目前國內(nèi)很多學(xué)者提出每天給藥3次,連續(xù)5～7天的給藥法,認(rèn)為與臨床用藥情況相合同時蓄積的

7、血藥濃度已近坪值。1.3采血時間理想的采血時間應(yīng)該在血藥濃度的高峰期。蒙一純[11]認(rèn)為,根據(jù)實驗動物消化生理特點和中藥吸收轉(zhuǎn)化特點確定取血時間范圍是合理的。如大鼠一般1～2小時可達(dá)血藥濃度峰值,此時血清即為含藥血清;時間延長將有部分藥物組分發(fā)生轉(zhuǎn)化,成為藥物代謝血清。一般采血時間多集中在末次給藥后30min～3小時間。由于中藥復(fù)方給藥后,不同藥物達(dá)峰時間不同,故對于采血時間很難有一個統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。筆者認(rèn)為應(yīng)對不同時間分別采血進(jìn)行預(yù)實驗,將不同時間的含藥血清進(jìn)行比較后再確定采血時間,是較為可靠和科學(xué)的方法。1

8、.4含藥血清的預(yù)處理和保存1.4.1含藥血清的預(yù)處理血清中有許多酶、抗體、補體及其他生物活性物質(zhì),它們對體外培養(yǎng)的組織細(xì)胞及離體組織器官可能有作用,甚至嚴(yán)重影響實驗結(jié)果。因此，在許多情況下有必要對血清進(jìn)行預(yù)處理。通常有3種方法。①丙酮法:向血清內(nèi)加入4～5倍量丙酮,混勻,于3000r/min離心,取上清液溫水浴上蒸發(fā),除去丙酮;②乙醇法:向血清內(nèi)加入4～5倍95%乙醇,混勻,于3000r/min離心,取上清液溫水浴上蒸發(fā),除去