血管緊張素ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

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1、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究作者：張建鄂,羅昌霞,張慶紅,李濤　[摘要]目的:研究血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。方法:血管緊張素Ⅱ（10-7μmol/l）加入腎小管上皮細(xì)胞為對照組；體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞作為空白對照；不同濃度纈沙坦（10-6μmol/l、10-7μmol/l、10-8μmol/l、10-9μmol/l）先與腎小管上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)半小時(shí)后再加入血管緊張素Ⅱ（10-7μmol/l）為干預(yù)組；EMSA、RT-PCR分別檢測不同時(shí)限NF-κB活性、骨橋蛋白mRNA表達(dá)。結(jié)果:血管緊張素Ⅱ可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞

2、內(nèi)NF-κB活性增加，骨橋蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)；而不同濃度纈沙坦干預(yù)組檢測結(jié)果顯示NF-κB活性、骨橋蛋白mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論:血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷與導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性增加、骨橋蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)有關(guān)。這一過程可能依賴血管緊張素ⅡⅠ型受體?！　關(guān)鍵詞]血管緊張素Ⅱ;腎小管上皮細(xì)胞;核轉(zhuǎn)錄因子-κB;骨橋蛋白　　Abstract：ObjectiveToexplorethemechanismofangiotensinⅡinducingtheinjuryofproximaltubularcells.Methods

3、Culturedcellsol/l）asthecontrol;culturedcellsol/l）astheinterventiongroup;proximaltubularcellsulationasblankcontrol;EMSA,RT-PCRRNAexpressionindifferentperiods,respectively.ResultsAngiotensinⅡcouldincreaseNF-κBactivityandupregulateOPNmRNAexpressioninproximaltubularcells.SA試劑盒（pr

4、omega公司）；血管緊張素Ⅱ（sigma公司）；RT-PCR試劑盒（BDBioscience公司）；TRIZOL（GiBco公司）；RNaseA抑制劑（Novagen公司）；引物（上海生工生物工程技術(shù)公司）；大鼠的腎小管上皮細(xì)胞株(NRK細(xì)胞)購至中科院上海細(xì)胞庫；冷凍離心機(jī)（Biofuge公司），二氧化碳溫箱（Formascientific公司）。纈沙坦由北京諾華公司提供?！　?.2細(xì)胞培養(yǎng)無菌條件下大鼠腎小管上皮細(xì)胞株，0.25%胰酶消化2min，觀察細(xì)胞分散成拉網(wǎng)狀，終止消化，加入RPMI1640培養(yǎng)液（含20%胎牛血清，300mg/l谷

5、氨酰胺、青霉素、鏈霉素）反復(fù)吹打，并分裝至培養(yǎng)皿，置于37℃二氧化碳溫箱中孵育；反復(fù)傳代，取第七代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用。　　1.3實(shí)驗(yàn)分組當(dāng)傳代細(xì)胞長至90%融合時(shí)換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12h。試驗(yàn)分組如下：①空白對照:未加刺激物的培養(yǎng)細(xì)胞。②對照組:血管緊張素Ⅱ（10-7μmol/l）加入培養(yǎng)細(xì)胞，分別于12、24h檢測NF-κB活性；12、24h檢測骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平；每個(gè)檢測指標(biāo)均設(shè)五個(gè)重復(fù)組。③干預(yù)組:不同濃度纈沙坦（10-6μmol/l、10-7μmol/l、10-8μmol/l、10-9μmol/l）加入培養(yǎng)細(xì)胞，半小時(shí)后再加入血管緊張素

6、Ⅱ（10-7μmol/l），分別于12h檢測NF-κB活性；12h檢測骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平；每個(gè)檢測指標(biāo)均設(shè)五個(gè)重復(fù)組?！　?.4EMSA的操作步驟①核蛋白的提取Bradford法定量。②EMSA的操作依試劑盒說明書（Cat#3050）進(jìn)行NF-κB寡核苷酸探針[r-32p]ATP標(biāo)記及EMSA法測定NF-κB活性。NF-κB同序寡核苷酸探針序列為3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5′；5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′。反應(yīng)結(jié)束后，在4%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳2h（電壓150V，電泳緩沖液為0.5×

7、TBE）。電泳完畢后干膠，-70℃放射自顯影。電泳結(jié)果經(jīng)密度掃描儀進(jìn)行半定量分析?！　?.5骨橋蛋白的RT-PCR操作步驟培養(yǎng)細(xì)胞接種至12孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞長至80%～90%融合時(shí)換無血清培養(yǎng)液，12h后按試驗(yàn)分組加藥物干預(yù)，每組細(xì)胞均設(shè)五個(gè)復(fù)孔。①TRIZOL提取總RNA，并測定濃度及260/280nm的吸光度（A）值。②按T1TANIUMTMone-stepRT-PCR試劑盒說明進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：50℃1h，90℃5min；94℃30′，65℃30′，68℃1min30個(gè)循環(huán)；68℃延伸2min，4℃保存。骨橋蛋白上游引物序列：5′AAGC

8、CTGACCCATCTCAGAA3′；骨橋蛋白下游引物序列為：5′GCAACTGGGATGACCTTGAT3′，產(chǎn)物長度446bp；設(shè)β