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《血管緊張素ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究作者:張建鄂,羅昌霞,張慶紅,李濤 [摘要]目的:研究血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷的機(jī)制。方法:血管緊張素Ⅱ(10-7μmol/l)加入腎小管上皮細(xì)胞為對照組;體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞作為空白對照;不同濃度纈沙坦(10-6μmol/l、10-7μmol/l、10-8μmol/l、10-9μmol/l)先與腎小管上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)半小時(shí)后再加入血管緊張素Ⅱ(10-7μmol/l)為干預(yù)組;EMSA、RT-PCR分別檢測不同時(shí)限NF-κB活性、骨橋蛋白mRNA表達(dá)。結(jié)果:血管緊張素Ⅱ可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞
2、內(nèi)NF-κB活性增加,骨橋蛋白mRNA表達(dá)上調(diào);而不同濃度纈沙坦干預(yù)組檢測結(jié)果顯示NF-κB活性、骨橋蛋白mRNA表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論:血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞損傷與導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性增加、骨橋蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)有關(guān)。這一過程可能依賴血管緊張素ⅡⅠ型受體?! 關(guān)鍵詞]血管緊張素Ⅱ;腎小管上皮細(xì)胞;核轉(zhuǎn)錄因子-κB;骨橋蛋白 Abstract:ObjectiveToexplorethemechanismofangiotensinⅡinducingtheinjuryofproximaltubularcells.Methods
3、Culturedcellsol/l)asthecontrol;culturedcellsol/l)astheinterventiongroup;proximaltubularcellsulationasblankcontrol;EMSA,RT-PCRRNAexpressionindifferentperiods,respectively.ResultsAngiotensinⅡcouldincreaseNF-κBactivityandupregulateOPNmRNAexpressioninproximaltubularcells.SA試劑盒(pr
4、omega公司);血管緊張素Ⅱ(sigma公司);RT-PCR試劑盒(BDBioscience公司);TRIZOL(GiBco公司);RNaseA抑制劑(Novagen公司);引物(上海生工生物工程技術(shù)公司);大鼠的腎小管上皮細(xì)胞株(NRK細(xì)胞)購至中科院上海細(xì)胞庫;冷凍離心機(jī)(Biofuge公司),二氧化碳溫箱(Formascientific公司)。纈沙坦由北京諾華公司提供?! ?.2細(xì)胞培養(yǎng)無菌條件下大鼠腎小管上皮細(xì)胞株,0.25%胰酶消化2min,觀察細(xì)胞分散成拉網(wǎng)狀,終止消化,加入RPMI1640培養(yǎng)液(含20%胎牛血清,300mg/l谷
5、氨酰胺、青霉素、鏈霉素)反復(fù)吹打,并分裝至培養(yǎng)皿,置于37℃二氧化碳溫箱中孵育;反復(fù)傳代,取第七代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用。 1.3實(shí)驗(yàn)分組當(dāng)傳代細(xì)胞長至90%融合時(shí)換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12h。試驗(yàn)分組如下:①空白對照:未加刺激物的培養(yǎng)細(xì)胞。②對照組:血管緊張素Ⅱ(10-7μmol/l)加入培養(yǎng)細(xì)胞,分別于12、24h檢測NF-κB活性;12、24h檢測骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平;每個(gè)檢測指標(biāo)均設(shè)五個(gè)重復(fù)組。③干預(yù)組:不同濃度纈沙坦(10-6μmol/l、10-7μmol/l、10-8μmol/l、10-9μmol/l)加入培養(yǎng)細(xì)胞,半小時(shí)后再加入血管緊張素
6、Ⅱ(10-7μmol/l),分別于12h檢測NF-κB活性;12h檢測骨橋蛋白mRNA表達(dá)水平;每個(gè)檢測指標(biāo)均設(shè)五個(gè)重復(fù)組?! ?.4EMSA的操作步驟①核蛋白的提取Bradford法定量。②EMSA的操作依試劑盒說明書(Cat#3050)進(jìn)行NF-κB寡核苷酸探針[r-32p]ATP標(biāo)記及EMSA法測定NF-κB活性。NF-κB同序寡核苷酸探針序列為3′-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5′;5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′。反應(yīng)結(jié)束后,在4%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳2h(電壓150V,電泳緩沖液為0.5×
7、TBE)。電泳完畢后干膠,-70℃放射自顯影。電泳結(jié)果經(jīng)密度掃描儀進(jìn)行半定量分析?! ?.5骨橋蛋白的RT-PCR操作步驟培養(yǎng)細(xì)胞接種至12孔培養(yǎng)板,當(dāng)細(xì)胞長至80%~90%融合時(shí)換無血清培養(yǎng)液,12h后按試驗(yàn)分組加藥物干預(yù),每組細(xì)胞均設(shè)五個(gè)復(fù)孔。①TRIZOL提取總RNA,并測定濃度及260/280nm的吸光度(A)值。②按T1TANIUMTMone-stepRT-PCR試劑盒說明進(jìn)行操作。反應(yīng)條件:50℃1h,90℃5min;94℃30′,65℃30′,68℃1min30個(gè)循環(huán);68℃延伸2min,4℃保存。骨橋蛋白上游引物序列:5′AAGC
8、CTGACCCATCTCAGAA3′;骨橋蛋白下游引物序列為:5′GCAACTGGGATGACCTTGAT3′,產(chǎn)物長度446bp;設(shè)β