凍干小鼠神經(jīng)生長因子的研制

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1、凍干小鼠神經(jīng)生長因子的研制　　摘要:目的研制小鼠神經(jīng)生長因子（NGF）.方法采用二次陽離子柱層析法，從雄性小鼠頜下腺分離提取2.5S神經(jīng)生長因子，建立了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室與中試生產(chǎn)工藝，以及相應(yīng)的質(zhì)量鑒定規(guī)程.結(jié)果從體質(zhì)量超過25g，鼠齡大于60d的雄性小鼠體內(nèi)可獲得高純度、高產(chǎn)量、高活性的2.5SNGF.純度大于95%，與抗2.5SNGF抗體有特異結(jié)合能力，雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測定的生物活性顯示，其比活性達(dá)到5×108BU・g-1（BU:生物活性單位）以上，各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn).20g・L-

2、1人血白蛋白做凍干賦形劑，能有效保護(hù)NGF的生物活性.結(jié)論研制了高質(zhì)量的凍干小鼠神經(jīng)生長因子，為NGF的臨床前和臨床研究奠定了基礎(chǔ).　　Keyouse;extraction;qualityassurance　　Abstract:AIMToinvestgateandputNGFonclinic.METHODSobley等［8］的二次陽離子柱層析法從小鼠頜下腺中制取2.5SNGF.首先用CMI層析柱在pH近中性條件下吸附頜下腺勻漿上清中等電點(diǎn)大于6.8的雜蛋白并予以分離去除，收集穿過峰;然后在pH小于5的條件下使NGF解離為

3、αNGF，βNGF以及γNGF亞基，利用βNGF與其他亞基等電點(diǎn)的差異，使用CMII層析柱吸附有生物活性的βNGF及其衍生物（共稱為2.5SNGF組分），分段洗脫，收集2.5SNGF組分.　　1.2.2紫外吸收光譜及蛋白含量測定用PEλ14型可見/紫外分光光度計對樣品進(jìn)行掃描，波長范圍為200～320nm;Lom，含pH3.5～10兩性電解質(zhì)，上樣樣品量20～30μL，電泳條件為:電壓1500V，功率1EM培養(yǎng)液，在無血清條件下37℃培養(yǎng)24～48h，倒置顯微鏡下進(jìn)行相差觀察，確定NGF提取物的生物活性，以突起生長最好的

4、稀釋度的倒數(shù)定為NGF生物活性單位（BU）.　　1.2.6凍干用生理鹽水配制的60g・L-1甘露醇或20g・L-1白蛋白將檢定合格的半成品稀釋至5×106BU・L-1，0.22μm濾膜過濾除菌.使用2mL西林瓶，每支分裝0.5mL，內(nèi)含2.5SNGF2500BU，凍干得成品，置4℃以下干燥處保存.　　2結(jié)果　　2.1鼠齡與體質(zhì)量對最終產(chǎn)量的影響鼠齡低于60d，體質(zhì)量少于20g的未成年小鼠，不僅最終NGF的產(chǎn)量明顯低于成年雄性小鼠，而且其生物活性也明顯低于標(biāo)準(zhǔn)，相反，使用體質(zhì)量超過

5、30g的種公鼠頜下腺，2.5SNGF的終產(chǎn)量更高（Tab1），制備量擴(kuò)大至每次2000只成年雄鼠，獲得了相似的結(jié)果.　　2.2紫外吸收光譜及蛋白質(zhì)含量2.5SNGF提取物呈典型的蛋白吸收曲線，最大吸收峰值為（280±1）nm;半成品蛋白含量大于0.15g・L-1.　　2.3純度及分子質(zhì)量在SDS-PAGE電泳中，純化產(chǎn)物形成一條稍寬的帶（Fig1），凝膠掃描純度大于95%，Mr為13500.　　表1小鼠鼠齡和體質(zhì)量對NGF產(chǎn)量與活性的影響　略　　圖1略　　2.4鑒別試驗(yàn)與等電點(diǎn)將2.5SNGFSDS-PAG

6、E帶轉(zhuǎn)移到NC膜上，與NGF抗體進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)免疫顯色，NC膜上相應(yīng)于2.5SNGF帶處出現(xiàn)1條棕色帶（Fig2）;等電聚焦電泳出現(xiàn)3條帶，其pI值分別為8.7，9.0和9.2（Fig3）.　　圖3略　　2.6賦形劑和保護(hù)劑的選擇采用60g・L-1甘露醇做賦形劑和保護(hù)劑，凍干后成形、色澤均良好，但其生物活性損失很大;使用20g・L-1白蛋白，凍干后活性無損失，各種理化指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)，但成形稍差，結(jié)構(gòu)略顯疏松.　　3討論　　NGF主要于唾液腺如頜下腺、前列腺、蛇毒及腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元支配區(qū)，其中

7、以成年雄性小鼠頜下腺含量最高.小鼠頜下腺NGF是7SNGF的高分子物，含有α，β，γ3個亞單位，具有生物活性的是同源β二聚體，每個單體含118個氨基酸，Mr約13500，等電點(diǎn)約9.2.研究結(jié)果［10，11］顯示人鼠間NGF基因編碼的β亞單位氨基酸序列同源性高達(dá)89%，且哺乳動物NGF受體具有高度的保守性，表明不同物種間的NGF具有相同的生物學(xué)功能.因此我們選擇成年雄性小鼠為研究對象，建立了從其頜下腺分離純化βNGF的制備工藝及相應(yīng)的質(zhì)量檢定標(biāo)準(zhǔn).　　βNGF肽鏈常發(fā)生兩種修飾，一種發(fā)生在N端，水解失去含8個氨基酸殘基的

8、肽段，另一種發(fā)生在C端，水解失去一個精氨酸殘基.這就衍生出NGF的多種形式，它們彼此之間存在著等電點(diǎn)、分子質(zhì)量的微小差異.因沉降系數(shù)約為2.5，故被統(tǒng)稱為2.5SNGF.因?yàn)樯鲜鲂揎棽簧婕盎钚灾行牟课恢匾陌被釟埢?，所以各種形式仍具有βNGF的全部活性［12，13］.我們純化的2.5SNGF在等電聚焦電泳中出現(xiàn)3條