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1、桂利嗪對興奮毒致癡呆大鼠模型海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響【關(guān)鍵詞】桂利嗪;興奮毒;單胺類遞質(zhì) 興奮性毒性損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷時神經(jīng)元變性壞死的重要機(jī)制之一〔1〕。喹啉酸(QA)是一種潛在的內(nèi)源性毒物，有研究在海馬CA1區(qū)注入QA，利用其選擇性破壞谷氨酸(Glu)能神經(jīng)元的特性，制備成Glu能毀損的學(xué)習(xí)記憶障礙模型〔2〕。桂利嗪(Cin)為鈣離子阻斷劑，對腦缺血損傷具有良好的療效〔3，4〕，但Cin對QA所致海馬神經(jīng)元損傷是否有保護(hù)作用尚未見報道。本實(shí)驗(yàn)利用興奮毒損傷方法建立大鼠阿爾茨海默病(AD)模型，研究Ci
2、n對AD動物模型學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的保護(hù)作用，為其防治提供理論依據(jù)?！ ?材料與方法 1.1動物與儀器雄性4月齡健康orris水迷宮和大鼠穿梭箱(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥研所)，3k30型低溫超速離心機(jī)(美國Sigma公司)，BH-2型光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)?！ ?.2藥品與試劑Cin(美國Sigma公司，批號20021206，含量>99.4%)，QA(Aldrich化學(xué)公司，批號20010701，含量>99.6%)，酪氨酸羥化酶(TH)測定試劑盒、色氨酸羥化酶(TPH)檢測試
3、劑盒均由武漢博士德公司提供。免疫組化試劑盒由北京中杉公司提供?！ ?.3動物分組動物經(jīng)行為學(xué)篩選后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5個組，假手術(shù)組、模型組及3個Cin治療組(n=8)。3個Cin治療組為動物手術(shù)后立即分別灌胃Cin7、20、60mg/kg;假手術(shù)組及模型組分別給予等量滅菌生理鹽水灌胃?！ ?.4模型的制作〔5〕實(shí)驗(yàn)動物用水合氯醛以350mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉后，剪去顱頂切口區(qū)毛，固定在大鼠腦立體定位儀上。酒精消毒后，取顱頂正中切口，參照大鼠腦立體定位圖譜〔6〕(AP：3.5mm，ML:2.0mm，H:2.7m
4、m)，對雙側(cè)海馬CA1區(qū)立體定位后，鉆開顱骨，用微量注射器垂直進(jìn)針，將溶解的QA2μl(含150nmol)緩慢注入海馬CA1區(qū)，假手術(shù)組注入等量的PBS緩沖液。每側(cè)注入時間為5min，留針5min，局部消毒后縫合皮膚?！ ?.5行為學(xué)檢測模型制備后1in，再經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟處理，在400倍光鏡下觀察各組標(biāo)本海馬CA1區(qū)的尼氏體形態(tài)改變。③TH和TPH免疫組化法染色將組織切片粘貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟處理后，作SABC免疫組化染色，參照北京中山公司的試劑盒說明進(jìn)行，每張切
5、片滴加50μl一抗(稀釋度為1∶200，Sigma公司)，4℃孵育過夜，滴加生物素化山羊抗兔IgG(稀釋度為1∶150，博士德生物制劑公司)，37℃孵育，PBS漂洗，滴加SABC，37℃孵育，PBS漂洗，DAB顯色，常規(guī)復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色?！ ?.7神經(jīng)生化學(xué)觀察假手術(shù)組和模型組各取6只大鼠，快速斷頭，迅速取出大腦，在冰臺上分離出海馬，用4℃生理鹽水沖洗除去血液，在干冰上用濾紙拭干，稱重后立即置于冰浴的玻璃勻漿器中，以每mg組織加入0.01mol/L的高氯酸，于冰浴里勻
6、漿，勻漿速度盡可能保持一致，然后轉(zhuǎn)入有塞的離心管中，在低溫離心機(jī)內(nèi)以18000r/min的速度離心20min。然后參照劉德敏及張林魁之高效液相色譜電化學(xué)檢測法測量樣品中去甲腎上腺素(NA)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)的含量〔10〕?！ ?.8統(tǒng)計學(xué)方法采用EXCEL錄入，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，計量資料均用x±s描述，多組間比較采用單因素方差分析，重復(fù)檢測的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測定的方差分析?！ ?結(jié)果 2.1Cin對QA損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響(Morris水迷宮實(shí)驗(yàn))訓(xùn)練4d各組共
7、8次的平均潛伏期，Cin(20、60mg/kg)使損傷大鼠尋找平臺平均潛伏期減少，見圖1，并使其末次跨平臺次數(shù)明顯增加，假手術(shù)組、模型組、Cin(7mg/kg)、Cin(20mg/kg)和Cin(60mg/kg)的末次跨平臺次數(shù)分別為：11.25、5.26、6、7.63和10.25，其中Cin(20、60mg/kg)與模型組相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。 2.2Cin對QA損傷大鼠條件性學(xué)習(xí)記憶能力的影響訓(xùn)練圖1大鼠水迷宮尋找平臺平均潛伏期4d后，Cin(20、60mg/kg組)可劑
8、量依賴性地增加QA損傷大鼠的主動回避次數(shù)，降低主動回避潛伏期及被動回避潛伏期，與模型組相比有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，見表1?！ ?.3HE染色HE染色后光鏡下觀察，可見正常大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)目多，呈多層，排列整齊緊密，核呈圓形，大而清晰，核仁明顯，神經(jīng)纖維密集，排列整齊。QA損傷組海馬神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，脫失現(xiàn)象明顯，層次少
