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《姜黃素對(duì)骨髓瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其機(jī)制討論》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、姜黃素對(duì)骨髓瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其機(jī)制討論多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是一種起源于B淋巴細(xì)胞系并能夠產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白(M蛋白)的惡性增生性疾病，中老年人易患，是血液系統(tǒng)第二大常見惡性腫瘤。MM的發(fā)病是一個(gè)極其復(fù)雜的病理生理過程，其中遺傳學(xué)異常、骨髓微環(huán)境、細(xì)胞因子X絡(luò)，在MM的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用?！ 〗S素(curcumin)是從草本植物姜黃的根莖中提取出來的酚類色素。近年被證實(shí)其主要藥理作用是通過調(diào)控特定的靶基因如生長因子、轉(zhuǎn)錄因子等發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、抗
2、動(dòng)脈粥樣硬化、抗脂質(zhì)過氧化、抗病毒等作用。已有報(bào)道姜黃素能抑制人體多種腫瘤細(xì)胞的生長，包括小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、腎癌、前列腺癌等。不同的腫瘤細(xì)胞系涉及不同的機(jī)制。姜黃素對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的作用主要集中在其抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖及促進(jìn)凋亡，但對(duì)其遷移侵襲能力并無相關(guān)研究。含IQ模序的RasGTP酶活化蛋白1(IQmotif-containingGTPase-activatingprotein1，IQGAP1)是一個(gè)細(xì)胞骨架結(jié)合蛋白，通過接收和發(fā)射各種信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和細(xì)胞間黏附，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。我們的前
3、期工作已證實(shí)IQGAP1在骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)增高。IQGAP1是否在骨髓瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中起到重要作用?姜黃素是否能對(duì)IQGAP1在骨髓瘤細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮的作用有抑制或阻斷?本研究期望為MM的臨床治療提供新思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！ 〔牧虾头椒ā ?主要藥品和試劑 姜黃素(Sigma)用二甲基亞砜配成8mmol/L儲(chǔ)存液，使用前用無菌PBS稀釋至工作濃度。RPMI-1640培養(yǎng)液為Gibco產(chǎn)品，胎牛血清(fetalcalfserum，F(xiàn)CS)購自杭州四季青生物公司，其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國
4、產(chǎn)分析純。Matrigel膠購自BectonDickinson。Costar3422Transes;109/L密度接種于6孔板內(nèi)。姜黃素0、20、30及40μmol/L作用RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞24h，行2.3.3步驟實(shí)驗(yàn)?！ ?.3.3抽提蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，與1∶500稀釋度的抗IQGAP1抗體和適宜稀釋度的Ⅱ抗(羊抗鼠Ig-HRP)孵育，經(jīng)Odyssey顯色系統(tǒng)顯色，收集蛋白印跡圖
5、。 2.4遷移能力的測(cè)定 2.4.1取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按1109/L密度接種于6孔板內(nèi)。細(xì)胞分為姜黃素0μmol/L組、20μmol/L組、30μmol/L組和40μmol/L組，亞組分3組:RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后行2.4.2步驟遷移實(shí)驗(yàn)?！ ?.4.2將0.8μm孔徑的Transu;LRPMI-1640培養(yǎng)液，37℃放置1h。收集各組細(xì)胞，用無
6、血清培養(yǎng)液洗滌和重懸各組細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整至1109/L。小心棄除Transu;L各組細(xì)胞懸液至小室上腔。通過間隙加入600μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液至下腔，避免產(chǎn)生汽泡，培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后將Transu;L細(xì)胞懸液。吸取少量懸液充滿計(jì)數(shù)板池，在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞?！ ?.5Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn) 2.5.1取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按1109/L密度接種于6孔板內(nèi)。細(xì)胞分為姜黃素0μmol/L組、20μmol/L組、30μmol/L組和40μmol
7、/L組，亞組分3組:RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后行2.5.2步驟Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)?！ ?.5.2將-20℃保存的Matrigel，在冰上4℃過夜融化，在冰上用預(yù)冷的槍頭吸取100μLMatrigel加入冰預(yù)冷的300μL無血清培養(yǎng)液中，充分混勻。取上述稀釋的Matrigel50μL加入Transin，使Matrigel聚合成膠。細(xì)胞接種密度為2108/L。接種
8、方法、觀測(cè)時(shí)間及細(xì)胞收集、計(jì)數(shù)方法同遷移實(shí)驗(yàn)?！ ?.6RT-PCR法檢測(cè) 姜黃素作用后IQGAP1mRNA的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按1109/L密度接種于6孔板內(nèi)。姜黃素0或40μmol/L作用于RPMI8226-shIQGAP1組、RPMI8226-shRNA陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染RPMI8226組細(xì)胞24h，采用RNeasyMini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測(cè)定計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照OneStepRT-PCR試劑盒實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行RT-PCR?！ ?統(tǒng)計(jì)學(xué)
