elisa檢測甲胎蛋白

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1、實驗設計ELISA一步法檢測甲胎蛋白試驗精密度分析一、實驗原理：1、用抗-AFP單克隆抗體包被反應板，加入標準品和辣根過氧化物酶標記的抗-AFP多克隆抗體，然后進行溫育、洗滌，形成復合物，加入底物，顯色，用酶標儀檢測出吸光度。然后對所測得的吸光度值進行精密度分析。2、精密度是在相同條件下，對同一被測物多次測量，每次測量結果之間的接近程度；用標準差（S），變異系數(shù)（CV）,組內相關系數(shù)（ICC）來衡量一組平行測定值的精密度。二、實驗材料1、實驗儀器：加樣器（20ul，50~250ul）、恒溫箱或恒溫水浴箱、洗板機、酶標儀、

2、吸咀、吸水紙（或衛(wèi)生紙）、消毒缸，垃圾桶。2、實驗試劑:甲胎蛋白（AFP）定量檢測試劑盒（抗—AFP單克隆抗體的微孔板、酶結合物試劑、AFP標準品120ng/ml、標準品2400ng/ml、濃縮洗滌液、顯色劑A顯色劑B、終止液、封板膜）三、實驗方法1）用前30分鐘從冰箱中取出試劑和待測標本，恢復至室溫。2)將恒溫箱或恒溫水浴箱調至反應溫度37C0。3）將濃縮洗滌液用新鮮蒸餾水稀釋至500ml后備用。4）編號：將微孔按序編號。AFP標準品120ng/ml和AFP標準品2400ng/ml各20孔。5）加樣:加入標準品和辣根過

3、氧化物酶標記的抗-AFP多克隆抗體各50ul，輕輕振蕩搖勻。6）溫育：用封板膜封板后，置37℃溫育30分鐘。7）洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機每次浸泡20秒5次，最后一次結束后在紙上盡量拍干。8）顯色：每孔加顯色劑A和顯色劑B各50ul或1滴，輕輕振蕩混勻，置室溫避光顯色5分鐘，溫育10分鐘。9）加終止液：每孔加終止液50微升，輕輕振蕩混勻。10）比色測定：設定酶標儀主波長為450nm，次波長為630nm(用雙波長檢測），測定出各孔的吸光度。四、實驗結果判斷1、標準偏差越小表示精密度越好。（分為優(yōu)、良、中、差）2、變異系

4、數(shù)越小表示精密度越好，且變異系數(shù)<15%。3、計算組內相關系數(shù)（ICC），-------ICC表示測量對象個體差異的方差占總方差的比例，0≦ICC≦1，ICC越接近1，說明個體差異對總方差的影響越大，測量誤差對總方差的影響越小。一般認為ICC≧0.75時，說明測量結果的可重復性較好。五、實驗計算及統(tǒng)計學處理標準差（s）=變異系數(shù)（CV）=組間均方（MSa）=組內均方（MSe）=組內相關系數(shù)（ICC）=六、質量控制如何做室內質量控制？1.對所選的標準液進行校準。2.對所使用的方法（包括標準分析方法）自行配置標準物和選用質控

5、樣品進行方法精密度和準確精密度的準確測定，通過標準物穩(wěn)定性的觀察，使用頻繁的方法繪制質量控制圖。七、注意事項1、使用前試劑應搖勻，滴瓶應垂直滴加，同一廠商不同批次或不同廠商的試劑盒中各組分不得混用或互換。2、冰箱保存標本在使用前應恢復到室溫，輕輕搖勻，若標本有沉淀，應離心去除，并確定未變質才能使用。3、加標本和液體試劑時必須用加樣槍，并進行校對其準確性。加入不同標本或不同試劑組分時，應更換加樣器吸頭，以防止出現(xiàn)交叉感染。4、嚴格控制每步反應溫度和時間，操作應緊湊。5、顯色時必須先加底物液后加顯色洗液，以免顯色過低。6、用

6、酶標儀比色讀取結果時，應檫干酶標板底部，且孔內不能有氣泡，不要碰觸底部的外壁，指印或劃痕都可能影響A值。7、封板膜不能重復使用。8、所有樣品、廢液和廢棄物都應按傳染物處理。9、終止液為2M硫酸，使用時應注意安全。八、影響因素試劑、加樣、孵育、洗板、顯色、終止、讀板。