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1、第五章分子生物學(xué)研究法本章主要內(nèi)容一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件二、基因操作的主要技術(shù)原理三、基因克隆的載體系統(tǒng)四、基因的分離與鑒定一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；2.50年代提示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。重組DNA技術(shù)歷史上的主要事件基因工程的主要內(nèi)容或步驟:1.
2、從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。5.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。二、基因操作的主要技術(shù)原理1．核酸的凝膠電泳將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電
3、場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極→正極移動(dòng)。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。2．核酸的分子雜交技術(shù)在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過(guò)毛細(xì)管作用或
4、電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地"吸印"轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟： ??將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過(guò)程特稱為核酸印跡轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法 ??將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。所以有時(shí)也稱這類核酸雜交為印跡雜交。3．細(xì)菌的轉(zhuǎn)化所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征
5、發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的寄主菌株則稱做受體菌株。大腸桿菌是最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)菌株。在加入轉(zhuǎn)化DNA之前，必須預(yù)先用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使之呈感受態(tài)（CompetentCells）。Mg2+對(duì)維持外源DNA的穩(wěn)定性起重要作用，質(zhì)粒DNA中的抗生素是篩選標(biāo)記。 ???對(duì)絕大多數(shù)hsdR-，hsdM-突變體菌株（k12），每ugDNA可得107-108個(gè)轉(zhuǎn)化子。4、分子克隆技術(shù)（1）高質(zhì)量mRNA的制備應(yīng)用PromegaPolyATtractmRNAIsolationSystem分離Po
6、ly(A)RNA。將BiotinylatedOligo(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的Streptavidin，用磁場(chǎng)吸附與PMP相連的SA-BiotinylatedOligo(dT)-mRNA。（2）反轉(zhuǎn)錄成cDNA可同時(shí)在反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中加入Oligo（dT）12-18-mer及隨機(jī)引物R6，以保證得到全長(zhǎng)cDNA；應(yīng)選用活性較高的反轉(zhuǎn)錄酶（Reversetranscriptase）；應(yīng)選用甲基化dCTP；應(yīng)保證所獲得雙鏈cDNA的方向性。(一)、限制性核酸內(nèi)切酶的概念核酸酶可分為兩類：核酸外切酶（exonuclease）
7、是從核酸的一端開(kāi)始，一個(gè)接一個(gè)把核苷酸水解下來(lái)；核酸內(nèi)切酶(endonuclease)則從核酸鏈中間水解3’，5’磷酸二酯鍵，將核酸鏈切斷。很多細(xì)菌和細(xì)胞中都能識(shí)別外來(lái)的核酸并將其分解，1962年發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)榧?xì)菌中含有特異的核酸內(nèi)切酶,能識(shí)別特定的核酸序列而將核酸切斷;同時(shí)又伴隨有特定的核酸修飾酶,最常見(jiàn)的是甲基化酶,能使細(xì)胞自身核酸特定的序列上堿基甲基化,從而避免受內(nèi)切酶水解,外來(lái)核酸沒(méi)有這種特異的甲基化修飾,就會(huì)被細(xì)胞的核酸酶所水解.這樣細(xì)胞就構(gòu)成了限制一修飾體系,其功能就是保護(hù)自身的DNA,分解外來(lái)的DNA,以保護(hù)和維持自身遺傳信息的穩(wěn)
8、定,這對(duì)細(xì)菌的生存和繁衍具有重要意義。這就是限制性核酸內(nèi)切酶名稱中“限制”二字概念的由來(lái)。三.限制性核酸內(nèi)切酶按酶的來(lái)源的屬、種名而定，取屬名的第一個(gè)字母與種名的頭
