實驗八 線粒體和液泡系的超活染色與觀察

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1、實驗八線粒體和液泡系的超活染色與觀察實驗目的1.????????觀察動、植物活細胞內(nèi)線粒體、液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布。2.????????學習一些細胞器的超活染色技術(shù)。?實驗原理活體染色是指對生活有機體的細胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學變化以致引起細胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類，體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)

2、里，達到易于識別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。活體染料之所以能固定、堆積在細胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學“特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用；一般是以堿性染料最為適用，可能因為它具有溶解在類脂質(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于被細胞

3、吸收。詹納斯綠B(JanusgreenB)和中性紅(neutralred)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色各有專一性。詹納斯綠B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進行超活染色，這是由于線粒體內(nèi)的細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))，呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質(zhì)中，這些染料被還原為無色的色基(即無色狀態(tài))。中性紅為弱堿性染料，對液泡系(即高爾基體)的染色有專一性，只將活細胞中的液泡系染成紅色，細胞核與細胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關實品驗用一、材料人口腔上皮細胞、洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞二、器材顯

4、微鏡、恒溫水浴鍋、表面皿，吸管、牙簽、吸水紙三、試劑1．Ringer溶液???氯化鈉??????0.85g??(變溫動物用0.65g)氯化鉀??????0.25g氯化鈣??????0.03g蒸餾水??????100ml2.1%詹納斯綠B溶液（原液）稱取50mg詹納斯綠B溶于5mlRinger溶液中，稍加微熱(30~40℃)，使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%原液。3.詹納斯綠B溶液（應用液）取1%原液lml加入49mlRinger溶液，混勻即可.最好現(xiàn)用現(xiàn)配4.10%、1/3000中性紅溶液：稱取0.5g中性紅溶于50mlRinger液，稍加熱(30~40℃)使之很快溶

5、解，用濾紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29mlRinger溶液混勻，裝入棕色瓶備用。實驗操作(一)人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色觀察??1．取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴1／5000詹納斯綠B染液。??2．實驗者用牙簽寬頭在自己口腔粘膜處稍用力刮取上皮細胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色l0—15min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液)，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置顯微鏡下觀察。??3．在低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細胞，換高倍鏡或油鏡進

6、行觀察。可見扁平狀上皮細胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即是線粒體。(二)洋蔥鱗莖表皮細胞線粒體的超活染色觀察??1．用吸管吸取l／5000詹納斯綠B染液，滴一滴于干凈的載玻片上，然后，撕取小片洋蔥鱗莖內(nèi)表皮，置于染液中，染色10一15min。??2．用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內(nèi)表皮組織展平，蓋上蓋玻片進行觀察。??3．在高倍鏡下，可見洋蔥表皮細胞中央被一大液泡所占據(jù)，細胞核被擠至一側(cè)貼細胞壁處。仔細觀察細胞質(zhì)中線粒體的形態(tài)與分布。?(三)植物細胞液泡系的中性紅染色觀察???1.實驗前，把小麥種子或黃豆培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)潮

7、濕的濾紙上，使其發(fā)芽，胚根伸長到1cm以上。???2．用雙面刀片把初生的小麥或黃豆幼苗根尖(約l一2cm長)小心切一縱切面，放入載玻片內(nèi)的l／3000中性紅染液滴中，染色5一10min。???3．吸去染液，滴一滴Ringer液，蓋上蓋玻片，并用鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察。???4．在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點的細胞，可見細胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細胞中，一般只有一個淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細