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《實驗技術(shù) 膠體金》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、實驗一：TEM包埋塊的制備一、實驗目的學習掌握常規(guī)生物樣品前處理技術(shù)及樣品包埋塊的制備技術(shù)。二、實驗材料小鼠肝臟細胞三、實驗試劑2.5％戊二醛、PBS、1％鋨酸、30％丙酮、100％丙酮、Epon812包埋液、蠟油四、實驗器材離心管、玻璃棒、滴管、移液槍、刀片、鑷子、牙簽、烘箱、切片機五、溶液配置1、磷酸緩沖液（PhosphateBufferSaline,PBS）0.2molL-1PBS配制A液：Na2HPO4.2H2O35.61g加DDW至1000mlB液：NaH2PO4.H2O27.6g加DDW至1000ml2、不同pH磷酸緩沖液的配制pH6.66
2、.87.07.27.47.6A液(ml)18.824.530.536.040.543.5B液(ml)31.225.519.514.09.56.53、Epon812包埋液的配制9Epon812樹脂20mlDDSA4.6mlMNA15.3mlDMP-300.8ml六、實驗步驟1、切取1mm3左右大小的組織塊，立即放入PBS（pH7.2)配制的2.5%戊二醛中固定10-15分鐘。2、用0.1molPBS緩沖液沖洗三次（每次3～5分鐘）。3、1％鋨酸固定30分鐘，然后用緩沖液沖洗三次（每次3～5分鐘）。4、丙酮脫水：30％－50％－70％－80％－90％－10
3、0％－100％，每級3～5分鐘5、浸透與包埋：脫水劑：包埋劑=1：2，過夜6、第二天任意時間進行包7、標簽用硫酸紙內(nèi)8、聚合：45℃12h60℃24h樣品標簽學號9七、注意事項1、取材的時候動作要迅速，組織離體后應將其快速放入固定液中。并且要盡量減少損傷，減少牽拉或擠壓組織。組織塊的大小一般為1mm3。2、用固定液固定的樣品若漂浮在溶液表面，應通過抽真空的方法讓樣品沉入溶液中。3、餓酸為劇毒、極易揮發(fā)的試劑，使用時要注意安全。4、脫水時要逐級脫水，而不能急劇脫水，更換液體時動作要快，不要讓組織離開溶液，否則會在組織內(nèi)外產(chǎn)生氣泡。5、在制備支持膜的時候手
4、一定要穩(wěn)，不能抖動，這樣制出的膜才會厚薄均一。在將載玻片浸水的時候要緩慢入水，這樣才會使膜利用水的張力慢慢的離開載玻片，漂浮在水面上。9實驗二、支持膜和膠體金的制備一、實驗原理氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金顆粒由一個基礎金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負離子（AuC12－），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中，以維持膠體金游離于溶膠間的懸液狀態(tài)。膠體金標記，實質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程
5、。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結(jié)合。用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒。免疫金標記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中，這一反應也可以通過銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。檸檬酸三鈉法0.01%氯金酸（HAuCl4)水溶液100ml加熱至沸騰，加4ml1%
6、檸檬酸三鈉水溶液，出現(xiàn)酒紅色。金顆粒大小與檸檬酸三鈉的關(guān)系檸檬酸三鈉（ml)41.51.00.75金顆粒的直徑（nm)15305060二、實驗步驟1、膠體金pH的調(diào)節(jié)：用0.1molK2CO3調(diào)到pH9.02、取7支2ml離心管分別加入1ml膠體金3、再向每支管中加入1ml不同濃度的牛血清白蛋白4、混合均勻后分別加入0.1ml10%NaCl膠體金與標記蛋白的配比：蛋白含量ug（牛血清白蛋白）5、混合均勻后按照下圖觀察顏色的變化96、確定出包裹膠體金蛋白的量三、注意事項1、配制膠體金溶液的pH以中性（pH7.2）較好。2、氯金酸的質(zhì)量要求上乘，雜質(zhì)少。最
7、好是進口的。3、玻璃器皿必須徹底清洗，最好是經(jīng)過硅化處理的玻璃器皿，或用第一次配制的膠體金穩(wěn)定的玻璃器皿，再用雙餾水沖洗后使用。否則影響生物大分子與金顆粒結(jié)合和活化后金顆粒的穩(wěn)定性，不能獲得預期大小的金顆粒。9實驗三、制片及超薄切片演示TEM、SEM觀察一、實驗目的1、掌握透射電子顯微鏡的成像基本原理及其應用2、掌握掃描電子顯微鏡的成像基本原理及其應用二、實驗原理1、透射電子顯微鏡的成像基本原理在真空條件下，電子束經(jīng)高壓加速后，穿透樣品時形成散射電子和透射電子，它們在電磁透鏡的作用下在熒光屏上成像。2、掃描電子顯微鏡的成像基本原理利用二次電子信號成像來
8、觀察樣品的表面形態(tài)。電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成像。三、主
