剪接因子srp55原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達

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1、剪接因子SRp55原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達【摘要】目的：本研究通過擴增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因，構(gòu)建GST融合蛋白原核表達質(zhì)粒pGEX-2T/SRp55，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達并進行純化。方法：用PCR法擴增SRp55基因，將擴增產(chǎn)物和載體pGEX-2T進行雙酶切后回收，連接載體和目的片段，獲得重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。在大腸桿菌BL21（DE3）中通過IPTG進行誘導(dǎo)表達，然后用谷胱甘肽-瓊脂糖球珠，親和純化得到純的GST-SRp55融合蛋白。結(jié)果：SRp55基因以正確的閱讀框架插入pGEX-2T。IPTG誘導(dǎo)大

2、腸桿菌BL21（DE3）表達，隨誘導(dǎo)時間的增加蛋白表達量增高，4h以后接近最高表達量。通過親和純化得到分子量在60kD左右的蛋白，經(jīng)蛋白印跡分析證實為GST-SRp55融合蛋白。結(jié)論：成功地構(gòu)建了GST融合蛋白原核表達質(zhì)粒pGEX-2T/SRp55，并獲得GST-SRp55融合蛋白，為進一步研究tau蛋白可變剪接機制提供了必要的基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】SRp55Tau原核表達剪接因子[Abstract]Objective:ToexpressandpurifyGlutathioneSTransferase(GST)-fusionproteinofSRp55,as

3、plicingfactor,inE.colicells.Methods:ThecDNAofSRp55plifiedbypolymerasechainreaction(PCR)andinsertedintopGEX-2TH1andEcoR1restrictionsites.TherebinantplasmidofpGEX-2T/SRp55edintoE.colicellstoexpressGST-SRp55.TheexpressedGST-SRp55intheE.colicellstheextractbyaffinitypurification.Thep

4、urityofGST-SRp55e.TheexpressionofGST-SRp55couldbeinducedbyaddingIsopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)inatime-dependentmanner.TheexpressionlevelachievedthehighestafteraddingIPTGfor4hours.ThepurifiedGST-SRp55byglutathione(GSH)-agarosebeadsshoajorbandbycoomassiebluestaining,E.

5、colicells，ain）而得名[3]。SR蛋白通過它帶有的1個或2個拷貝的RNA識別基序（RRM）與RNA結(jié)合，并決定各SR蛋白的底物特異性，因此RS結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白之間的相互作用[4]。Tau蛋白是存在于神經(jīng)元中主要的微管相關(guān)蛋白，其功能是促進微管聚合和穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)。在正常人腦中，tau蛋白有6種變異體，而這6種變異體是由單一的基因編碼通過不同的剪接而形成的。其中，外顯子10的編碼與否決定了tau蛋白含有4個或3個微管結(jié)合重復(fù)片斷（4repeatsor3repeats,4R或3R）[5]。在正常人腦中，3R和4R的比例大約是1∶1，但在某些17號染

6、色體連鎖性前額顳葉癡呆合并帕金森綜合征(FTDP－17)的病人腦中，由于某些突變引起外顯子10的編碼，使得4R和3R的比例大于1[6]。而在某些神經(jīng)退行性疾病中，由于tau基因第280位編碼精氨酸的核苷酸缺失，只產(chǎn)生編碼3R的tau蛋白，從而使得其結(jié)合微管的能力降低[7]。因此，tau蛋白的剪接正確與否與某些神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。在胚胎的人腦中，只有3R的存在，沒有外顯子10的編碼[8]?；谂咛ズ统赡杲M織的DNA結(jié)構(gòu)的同一性，造成胚胎和成年人腦tau蛋白表達不同顯示反式作用因子在tau蛋白可變剪接中的重要調(diào)控作用。因此探討和研究參與tau蛋白剪接的剪接

7、因子將有助于我們揭示tau蛋白的剪接機理，為某些神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療提供有價值的依據(jù)。SRp55是SR蛋白家族中的成員之一，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它參與許多蛋白包括tau蛋白的剪接，它的功能受磷酸化調(diào)控。為了更好地研究SRp55，特別是SRp55蛋白磷酸化在tau蛋白剪接中作用的研究，我們構(gòu)建了谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）和SRp55融合的原核表達質(zhì)粒，并在大腸桿菌中成功地誘導(dǎo)表達，分離純化得到了GST-SRp55融合蛋白。這為以后我們對Tau可變剪接機制的研究提供了必要的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料（1）實驗菌株和質(zhì)粒：E.coli菌株BL21(DE3)由本實

8、驗室保存，pGEX-2T為Amarsham公司產(chǎn)品，pCEP4-SRp55真核表達質(zhì)粒由臺灣中