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《剪接因子srp55原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、剪接因子SRp55原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達【摘要】目的:本研究通過擴增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因,構(gòu)建GST融合蛋白原核表達質(zhì)粒pGEX-2T/SRp55,并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達并進行純化。方法:用PCR法擴增SRp55基因,將擴增產(chǎn)物和載體pGEX-2T進行雙酶切后回收,連接載體和目的片段,獲得重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。在大腸桿菌BL21(DE3)中通過IPTG進行誘導(dǎo)表達,然后用谷胱甘肽-瓊脂糖球珠,親和純化得到純的GST-SRp55融合蛋白。結(jié)果:SRp55基因以正確的閱讀框架插入pGEX-2T。IPTG誘導(dǎo)大
2、腸桿菌BL21(DE3)表達,隨誘導(dǎo)時間的增加蛋白表達量增高,4h以后接近最高表達量。通過親和純化得到分子量在60kD左右的蛋白,經(jīng)蛋白印跡分析證實為GST-SRp55融合蛋白。結(jié)論:成功地構(gòu)建了GST融合蛋白原核表達質(zhì)粒pGEX-2T/SRp55,并獲得GST-SRp55融合蛋白,為進一步研究tau蛋白可變剪接機制提供了必要的基礎(chǔ)。【關(guān)鍵詞】SRp55Tau原核表達剪接因子[Abstract]Objective:ToexpressandpurifyGlutathioneSTransferase(GST)-fusionproteinofSRp55,as
3、plicingfactor,inE.colicells.Methods:ThecDNAofSRp55plifiedbypolymerasechainreaction(PCR)andinsertedintopGEX-2TH1andEcoR1restrictionsites.TherebinantplasmidofpGEX-2T/SRp55edintoE.colicellstoexpressGST-SRp55.TheexpressedGST-SRp55intheE.colicellstheextractbyaffinitypurification.Thep
4、urityofGST-SRp55e.TheexpressionofGST-SRp55couldbeinducedbyaddingIsopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)inatime-dependentmanner.TheexpressionlevelachievedthehighestafteraddingIPTGfor4hours.ThepurifiedGST-SRp55byglutathione(GSH)-agarosebeadsshoajorbandbycoomassiebluestaining,E.
5、colicells,ain)而得名[3]。SR蛋白通過它帶有的1個或2個拷貝的RNA識別基序(RRM)與RNA結(jié)合,并決定各SR蛋白的底物特異性,因此RS結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白之間的相互作用[4]。Tau蛋白是存在于神經(jīng)元中主要的微管相關(guān)蛋白,其功能是促進微管聚合和穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)。在正常人腦中,tau蛋白有6種變異體,而這6種變異體是由單一的基因編碼通過不同的剪接而形成的。其中,外顯子10的編碼與否決定了tau蛋白含有4個或3個微管結(jié)合重復(fù)片斷(4repeatsor3repeats,4R或3R)[5]。在正常人腦中,3R和4R的比例大約是1∶1,但在某些17號染
6、色體連鎖性前額顳葉癡呆合并帕金森綜合征(FTDP-17)的病人腦中,由于某些突變引起外顯子10的編碼,使得4R和3R的比例大于1[6]。而在某些神經(jīng)退行性疾病中,由于tau基因第280位編碼精氨酸的核苷酸缺失,只產(chǎn)生編碼3R的tau蛋白,從而使得其結(jié)合微管的能力降低[7]。因此,tau蛋白的剪接正確與否與某些神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。在胚胎的人腦中,只有3R的存在,沒有外顯子10的編碼[8]?;谂咛ズ统赡杲M織的DNA結(jié)構(gòu)的同一性,造成胚胎和成年人腦tau蛋白表達不同顯示反式作用因子在tau蛋白可變剪接中的重要調(diào)控作用。因此探討和研究參與tau蛋白剪接的剪接
7、因子將有助于我們揭示tau蛋白的剪接機理,為某些神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療提供有價值的依據(jù)。SRp55是SR蛋白家族中的成員之一,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它參與許多蛋白包括tau蛋白的剪接,它的功能受磷酸化調(diào)控。為了更好地研究SRp55,特別是SRp55蛋白磷酸化在tau蛋白剪接中作用的研究,我們構(gòu)建了谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和SRp55融合的原核表達質(zhì)粒,并在大腸桿菌中成功地誘導(dǎo)表達,分離純化得到了GST-SRp55融合蛋白。這為以后我們對Tau可變剪接機制的研究提供了必要的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料(1)實驗菌株和質(zhì)粒:E.coli菌株BL21(DE3)由本實
8、驗室保存,pGEX-2T為Amarsham公司產(chǎn)品,pCEP4-SRp55真核表達質(zhì)粒由臺灣中