重組質(zhì)粒的原核表達

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1、實驗九表達質(zhì)粒的構(gòu)建與誘導表達第一節(jié)原核表達概述基因工程的研究一方面是獲得基因的表達產(chǎn)物，另一方面是研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，最終都涉及目的基因的表達問題。表達載體（expressvector）是指本身攜帶有宿主細胞基因表達所需的調(diào)控序列，能使克隆的基因在宿主細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄與翻譯的載體。也就是說，克隆載體只是攜帶外源基因，使其在宿主細胞內(nèi)擴增；表達載體不僅使外源基因擴增，還使其表達。表達載體在基因工程中具有十分重要的作用。外源基因在宿主（受體）細胞內(nèi)是否表達以及表達水平受到許多因素（調(diào)控元件）的制約：1．正確的閱讀框架為了獲得正確編碼的外源蛋白，外源基因編碼區(qū)在插入表達質(zhì)粒中原核

2、基因編碼區(qū)時，閱讀框架應保持一致。閱讀框架是由每三個核苷酸為一組連接起來的編碼序列，外源基因只有在它與載體DNA的起始密碼相吻合時，才算處于正確的閱讀框架之中，從而表達融合蛋白，使外源蛋白與宿主蛋白相融合。2．目的基因有效轉(zhuǎn)錄的啟動子啟動子(promoter)是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調(diào)控序列。原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成的，分別稱為一35區(qū)和一10區(qū)。一35區(qū)的序列為TTGACA，一10區(qū)序列為TATAAT。此兩序列之間的最佳間距為17bp?？膳cRNA聚合酶結(jié)合，并指導該酶在正確的轉(zhuǎn)錄部位

3、開始合成mRNA。由于細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達載體必須用原核啟動子帶動真核基因在原核生物中轉(zhuǎn)錄。原核表達載體啟動子的轉(zhuǎn)錄常常是可以控制的，即一般情況下不轉(zhuǎn)錄，而受誘導劑誘導時就能轉(zhuǎn)錄，帶動外源基因的高效表達。目前常用的啟動子：如大腸桿菌的lac啟動子是乳糖操縱子的啟動子，受lacⅠ編碼的阻遏蛋白調(diào)節(jié)控制；trp等啟動子是色氨酸操縱子啟動子，受trpR編碼的阻遏蛋白調(diào)節(jié)控制；tac啟動子，由lac啟動子的一l0區(qū)和trp啟動子的一35區(qū)融合而成，匯合了lac和trp兩者優(yōu)點，是一個很強的啟動子，受lacⅠ編碼的阻遏蛋白調(diào)節(jié)；lacUV5啟動子是經(jīng)紫外線

4、誘變改造后的lac啟動子，該啟動子失去CAP和cAMP的正調(diào)控，只要有乳糖或IPTG存在時就能夠啟動轉(zhuǎn)錄；噬菌體的λPL、R啟動子是λ噬菌體左、右向啟動子，是一個溫度敏感的阻遏蛋白受溫度調(diào)控的很強的啟動子；T7噬菌體啟動子，比大腸桿菌啟動子強得多，并且十分專一，只被T7RNA聚合酶所識別；SV40啟動子、多角蛋白啟動子以及花椰菜花葉病毒（CaMV）啟動子。3．轉(zhuǎn)錄終止子構(gòu)建表達載體時，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因干擾表達載體的穩(wěn)定性，一般要在多克隆位點的下游插入一段很強的核糖體RNA轉(zhuǎn)錄終止子(terminator)。否則合成的mRNA過長，不僅消耗細胞內(nèi)的底物和能量，而

5、且容易使mRNA形成妨礙翻譯的二級結(jié)構(gòu)。原核基因的轉(zhuǎn)錄終止序列包括依賴Rho蛋白和不依賴Rho蛋白兩種。不依賴Rho的終止信號序列都含發(fā)夾結(jié)構(gòu)，末端為一連串T及YRTCTG。4．mRNA有效翻譯的SD序列在原核生物中，mRNA分子上有兩個核糖體結(jié)合位點(ribosomebindingsite，RBS)也調(diào)節(jié)著mRNA的翻譯，一個是起始密碼(AUG或GUG)，另一個是位于起始密碼上游3～11個核苷酸處的由3～9個核苷酸組成的一段保守序列AGGAGGU，這段序列富含嘌呤核苷酸，稱為SD序列。而核糖體和mRNA的結(jié)合是由SD序列以及與起始密碼子AUG之間的距離決定的。因此，SD序列和它

6、的起始密碼子AUG之間的距離是影響外源基因在原核生物中表達量高低的重要因素。SD序列與AUG間隔9個堿基最為合適，其間距離過長或過短都會影響目的基因的表達，有時由于這種距離的影響，蛋白質(zhì)合成水平會相差2000倍以上。且SD序列與AUG之間的堿基最好是A或U，一3位最好是A。5．轉(zhuǎn)錄、翻譯后的適當修飾和加工真核生物基因表達的產(chǎn)物往往需要進行適當?shù)男揎椉庸ぃ捎诖竽c桿菌本身的蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工系統(tǒng)相當不完善，表達的真核蛋白質(zhì)不能形成適當?shù)恼郫B或糖基化修飾。并且不同宿主其修飾系統(tǒng)也不一樣，所以選擇宿主時應注意。6．信號序列(signalsequence)在原核細胞中，合成的蛋白能否

7、分泌到細胞外與mRNA編碼區(qū)上游的一段信號序列有關(guān)。這段編碼序列翻譯的15～30個氨基酸為蛋白質(zhì)N端的信號肽，它能攜帶蛋白質(zhì)跨膜并分泌到細胞外。脂雙層和負電荷的質(zhì)膜通過和信號肽的疏水相互作用以及電荷的吸引是信號肽能跨膜分泌的主要原因。當信號肽攜帶后面的蛋白質(zhì)跨膜分泌后，信號肽即被質(zhì)膜上的信號肽酶切除得到有功能的成熟蛋白質(zhì)。因此根據(jù)不同的需要，人們構(gòu)建了不同的在原核細胞中高效表達的載體，這些載體通常具有以下幾個特點：①有一個強的原核啟動子及兩側(cè)的調(diào)控序列；②位于讀碼框上游的SD序列