資源描述：
《重組cd13單鏈抗體-蝎毒素agap原核表達質粒的構建論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、重組CD13單鏈抗體/蝎毒素AGAP原核表達質粒的構建論文駱超，倪吳花，胡永仙，譚映霞，沈志堅，江松福，俞康【摘要】目的：構建pRSETA/AGAP/CD13scFv重組表達質粒，為重組CD13單鏈抗體/蝎毒素AGAP融合蛋白的表達奠定實驗基礎。方法:利用RT-PCR法從東亞鉗蝎尾腺中獲得AGAP目的基因.freelidpRSETA/AGAP/CD13scFvthatcontributestotheexpressionoffusionproteinAGAP/CD13scFv.Methods:TheAGA
2、PgeneButhusmartensiiKarschusingRT-PCR，thenitidPCR-TOPOandtransferredtoDH5α.TheobjectivegeneAGAPtherebinantcloningplasmid，andconnectedtotheexpressionplasmidpRSETAthateenzymes.Subsequently，CD13scFvplifiedfromplasmidpSecTag2HygroCidedigestionanalysisandsequ
3、encing.Results:TherebinantexpressionplasmidpRSETA/AGAP/CD13scFvButhusmartensiiKarschusingRT-PCR.CD13scFvcanbeamplifiedfromplasmidpSecTag2HygroCidpRSETA/AGAP/CD13scFvaresuccessfullyconstructed.TheconstructionofpRSETA/AGAP/CD13scFvhasagreatconstributionnot
4、onlytotheexpressionoffusionprotein，butalsotothetherapyofCD13positivetumors.CD13抗原在正常的髓細胞中有表達，但在急、慢性髓細胞白血病、骨髓增生異常綜合征和部分淋巴瘤中均高度表達，因此可以作為腫瘤靶向治療較為理想的靶點1。蝎毒素抗瘤止痛肽（AGAP）經證實在小鼠體內具有抗腫瘤和止痛活性2-3，為此，我們利用CD13單鏈抗體（CD13scFv）、AGAP構建pRSETA/AGAP/CD13scFv原核表達載體，為該重組質粒體外融合
5、蛋白的表達及今后研究CD13scFv和蝎毒素AGAP協同性殺傷CD13陽性腫瘤細胞提供了良好的實驗基礎及理論依據。1材料和方法1.1材料東亞鉗蝎（購自中華蝎子養(yǎng)殖有限公司），含CD13scFv的pSecTag2HygroC質粒（由德國Erlangen-Nuremberg大學生物遺傳學研究所主席KarinBarbin教授惠贈），pRSETA表達質粒（由北京大學麻洪博士惠贈），Trizol試劑、TOPO載體（購自美國Invitrogen公司），FermentasFirstStrandcDNASynthesi
6、sKit、PCRmix(均購自MBI公司)，HindIII內切酶、XhoI內切酶、EcoRI內切酶、T4DNALigase（均購自美國Biolabs公司），X-Gal、IPTG（均購自BBI公司），膠回收試劑盒、質粒小抽試劑盒（購自德國Qiagen公司），DH5α菌、JM109菌均為本實驗室保存。1.2方法1.2.1以RT-PCR法從東亞鉗蝎中獲得AGAP目的基因：電刺激東亞鉗蝎尾部，剪取其尾腺，在液氮下研磨，以Trizol一步法從中提取總RNA，Fermentas逆轉錄初始鏈cDNA合成試劑盒反轉錄為
7、cDNA，并以cDNA為模板，用PCRmix進行PCR擴增獲得目的基因。PCR引物根據Genbank中AGAP序列(No.AF464898)設計，引物為上游：5’CGGAATTCGAGtacgcgatggttatattgccgac3’，下游：5’CCCAAGCTTGCaccgccattgcattttcctggtact3’，劃線處分別為EcoRI和HindIII酶切位點，前后各有2～3個保護性堿基。PCR反應條件如下：94℃預變性5min，再以94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，共24
8、個循環(huán)。最后以72℃延伸10min。1.2.2PCR法從pSecTag2HygroC質粒中獲得CD13scFv目的基因：用PCRmix進行PCR擴增獲得目的基因，據德國GeorgH.Fey教授惠贈的CD13scFv序列設計其引物，上游：5’CCGCTCGAGatggcggactacaaagacgttgtga3’，下游：5’GGAATTCCggcggccgcactgccGccaccacca3’，劃線處分別為XhoI、EcoRI酶切位點，前后各
